TU Darmstadt / ULB / TUbiblio

Human myeloid enhanced model systems: Tools for advanced evaluation of short-term CAR T cells and in vivo CAR T cell generation

Ho, Naphang (2023)
Human myeloid enhanced model systems: Tools for advanced evaluation of short-term CAR T cells and in vivo CAR T cell generation.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00023009
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Immunotherapies have emerged as a viable treatment option in cancer, by harnessing the natural ability of the immune system to eliminate tumor cells. Additional modification of the effector cells paved the way for novel strategies, such as equipping T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) for efficient and target-specific tumor cell lysis. In particular, CD19CAR T cells showed tremendous results against B cell malignancies with currently four CD19CAR T cell products on the market. Despite the great successes CAR T cell manufacturing requires long ex vivo generation and cultivation time up to several weeks and therefore limits the application. Current efforts to reduce and avoid this limitation involves ex vivo manufacturing within few days and CAR T cell generation in vivo. This thesis evaluates these novel CAR T cell generation approaches in myeloid enhanced model systems to get a better understanding of potential safety risks and obstacles. Proof of concept for in vivo CAR T cell generation has been shown before with CD8 and CD4 receptor-targeted lentiviral vectors (CD8-LV and CD4-LV) in preclinical humanized mouse models. However, these studies were limited to humanized model systems that do not reflect the physiological myeloid cell composition in human accurately. That is why this thesis used the CD34+ stem cell humanized NSG-SGM3 (huSGM3) mouse model, which develops pronounced human innate immune cells including monocytes and macrophages, to evaluate in vivo CAR T cell generation. Intravenous (i.v.) injection of CD4-LV, CD8-LV or mixture of both vector types resulted in successful CD19CAR T cell generation in the blood of some mice. Importantly, CAR expression was restricted to the respective targeted CD4+ or CD8+ T cell subset without detectable off-target transduction. CD19+ target cell reduction in the system further underlined the presence of functional CD19CAR T cells in the periphery as well in various lymphocyte-residing and biodistribution-relevant organs. In addition, expansion of CAR T cells in the presence of tumor antigen confirmed presence and long persistence of CAR T cells in the spleen and transgene integration could be verified by qPCR analysis. Overall, in vivo CAR T cell generation was less efficient in huSGM3 compared to previous described CD34+ humanized NSG mice. Intriguingly, CD4-LV injected mice showed the least pronounced in vivo CAR T cell generation efficiency and correlated with a distinct plasma cytokine pattern associated with activated human myeloid cells. Reduced in vitro transduction of T cells with CD4-LV and CD8-LV in the presence of monocytes or macrophages identified these cells as potential barrier for in vivo CAR T cell generation. Strikingly, shielding CD4-LV and CD8-LV from phagocytosis, by using ß2M-/-, CD47high HEK-293T packaging cells for vector particle production, substantially improved CAR T cell generation in the co-culture. Furthermore, these modifications also improved in vivo CAR T cell generation in huSGM3 mice compared to conventional CD4-LV and CD8-LV. This was shown by higher vector copy numbers, more pronounced CD19+ cell reduction in the spleen and bone marrow for both shielded vector types and in addition by higher CAR T cell numbers in the blood for shielded CD4-LV. Reducing ex vivo CAR T cell generation time is another attractive approach to refine manufacturing. In this thesis CD19CAR T cells generated within 3 days (short-term CAR T cells) using lentiviral vector incubation were evaluated for cellular composition and potential to induce cytokine release syndrome (CRS), a common side effect in CAR T cell therapy. Characterization of short-term CAR T cells after production revealed that most of the cells were vector particle-bound and only a minority was CAR positive. A designed co-culture model with tumor cells and monocytes demonstrated tumor cell specific cytotoxicity for short-term CAR T cells, which showed substantial CAR expression after 24h of co-culture. Moreover, the co-culture model revealed high release of CRS-relevant cytokines including IL-6, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 and IL-10 during the killing assay. Using NSG-SGM3 mice with high tumor burden, i.v. administration of high numbers of short-term CAR T cells showed severe acute events within 24h. This included body signs of ill-being, temperature and weight drop and systemic cytokine elevation of human IFN-γ, TNF-α, IL-2 and IL-10 by short-term CAR T cells and murine MCP-1, IL-6 and G-CSF by the mouse system. Taken together, this thesis highlights the potential of sophisticated model systems to evaluate possible roadblocks and safety risks of novel CAR T cell therapy manufacturing approaches. They allowed the identification of human monocytes and macrophages as potential barrier for in vivo CAR T cell generation and highly supports the implementation of phagocytosis shielding in targeted LVs to reduce innate immune response for this approach. Moreover, such model systems revealed the potential of short-term CAR T cells to induce severe acute CRS and emphasize a careful approach in the clinic and further assessment on these model platforms.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2023
Autor(en): Ho, Naphang
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Human myeloid enhanced model systems: Tools for advanced evaluation of short-term CAR T cells and in vivo CAR T cell generation
Sprache: Englisch
Referenten: Löwer, Prof. Dr. Alexander ; Buchholz, Prof. Dr. Christian
Publikationsjahr: 2023
Ort: Darmstadt
Kollation: 142 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 15 Dezember 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00023009
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/23009
Kurzbeschreibung (Abstract):

Immunotherapies have emerged as a viable treatment option in cancer, by harnessing the natural ability of the immune system to eliminate tumor cells. Additional modification of the effector cells paved the way for novel strategies, such as equipping T cells with a chimeric antigen receptor (CAR) for efficient and target-specific tumor cell lysis. In particular, CD19CAR T cells showed tremendous results against B cell malignancies with currently four CD19CAR T cell products on the market. Despite the great successes CAR T cell manufacturing requires long ex vivo generation and cultivation time up to several weeks and therefore limits the application. Current efforts to reduce and avoid this limitation involves ex vivo manufacturing within few days and CAR T cell generation in vivo. This thesis evaluates these novel CAR T cell generation approaches in myeloid enhanced model systems to get a better understanding of potential safety risks and obstacles. Proof of concept for in vivo CAR T cell generation has been shown before with CD8 and CD4 receptor-targeted lentiviral vectors (CD8-LV and CD4-LV) in preclinical humanized mouse models. However, these studies were limited to humanized model systems that do not reflect the physiological myeloid cell composition in human accurately. That is why this thesis used the CD34+ stem cell humanized NSG-SGM3 (huSGM3) mouse model, which develops pronounced human innate immune cells including monocytes and macrophages, to evaluate in vivo CAR T cell generation. Intravenous (i.v.) injection of CD4-LV, CD8-LV or mixture of both vector types resulted in successful CD19CAR T cell generation in the blood of some mice. Importantly, CAR expression was restricted to the respective targeted CD4+ or CD8+ T cell subset without detectable off-target transduction. CD19+ target cell reduction in the system further underlined the presence of functional CD19CAR T cells in the periphery as well in various lymphocyte-residing and biodistribution-relevant organs. In addition, expansion of CAR T cells in the presence of tumor antigen confirmed presence and long persistence of CAR T cells in the spleen and transgene integration could be verified by qPCR analysis. Overall, in vivo CAR T cell generation was less efficient in huSGM3 compared to previous described CD34+ humanized NSG mice. Intriguingly, CD4-LV injected mice showed the least pronounced in vivo CAR T cell generation efficiency and correlated with a distinct plasma cytokine pattern associated with activated human myeloid cells. Reduced in vitro transduction of T cells with CD4-LV and CD8-LV in the presence of monocytes or macrophages identified these cells as potential barrier for in vivo CAR T cell generation. Strikingly, shielding CD4-LV and CD8-LV from phagocytosis, by using ß2M-/-, CD47high HEK-293T packaging cells for vector particle production, substantially improved CAR T cell generation in the co-culture. Furthermore, these modifications also improved in vivo CAR T cell generation in huSGM3 mice compared to conventional CD4-LV and CD8-LV. This was shown by higher vector copy numbers, more pronounced CD19+ cell reduction in the spleen and bone marrow for both shielded vector types and in addition by higher CAR T cell numbers in the blood for shielded CD4-LV. Reducing ex vivo CAR T cell generation time is another attractive approach to refine manufacturing. In this thesis CD19CAR T cells generated within 3 days (short-term CAR T cells) using lentiviral vector incubation were evaluated for cellular composition and potential to induce cytokine release syndrome (CRS), a common side effect in CAR T cell therapy. Characterization of short-term CAR T cells after production revealed that most of the cells were vector particle-bound and only a minority was CAR positive. A designed co-culture model with tumor cells and monocytes demonstrated tumor cell specific cytotoxicity for short-term CAR T cells, which showed substantial CAR expression after 24h of co-culture. Moreover, the co-culture model revealed high release of CRS-relevant cytokines including IL-6, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 and IL-10 during the killing assay. Using NSG-SGM3 mice with high tumor burden, i.v. administration of high numbers of short-term CAR T cells showed severe acute events within 24h. This included body signs of ill-being, temperature and weight drop and systemic cytokine elevation of human IFN-γ, TNF-α, IL-2 and IL-10 by short-term CAR T cells and murine MCP-1, IL-6 and G-CSF by the mouse system. Taken together, this thesis highlights the potential of sophisticated model systems to evaluate possible roadblocks and safety risks of novel CAR T cell therapy manufacturing approaches. They allowed the identification of human monocytes and macrophages as potential barrier for in vivo CAR T cell generation and highly supports the implementation of phagocytosis shielding in targeted LVs to reduce innate immune response for this approach. Moreover, such model systems revealed the potential of short-term CAR T cells to induce severe acute CRS and emphasize a careful approach in the clinic and further assessment on these model platforms.
Alternatives oder übersetztes Abstract:
Alternatives AbstractSprache

Immuntherapien haben sich als erfolgreiche Behandlungsmethode im Kampf gegen Krebs herausgestellt, indem die natürliche Fähigkeit des Immunsystems genutzt wird Tumorzellen zu bekämpfen. Zusätzliche Modifikationen an den Effektorzellen haben ein neues Feld eröffnet. Zum Beispiel die Ausstattung der T-Zellen mit einem chimären Antigen-Rezeptor (CAR), um spezifisch und effizient Tumorzellen zu eliminieren. Vor allem CD19-CAR-T-Zellen haben erstaunliche klinische Erfolge in B-Zell Krebserkrankungen gezeigt und spiegelt sich in der Marktzulassung von aktuell vier CD19-CAR-T-Zellprodukten wider. Trotz der großen Erfolge von CAR-T-Zellen ist die Anwendung dieser Therapie durch die lange ex vivo Produktionszeit limitiert, die mehrere Wochen andauern kann. Derzeitige Bemühungen die Produktionszeit zu verkürzen oder zu vermeiden, beinhalten die ex vivo Herstellung von CAR-T-Zellen innerhalb weniger Tage oder die Erzeugung von CAR-T-Zellen in vivo im Körper. Die vorliegende Arbeit untersucht diese neuen Herstellungsansätze näher in Modelsystemen mit besonderem Fokus auf myeloiden Zellen, um ein besseres Verständnis über potenzielle Sicherheitsrisiken und Hürden in der klinischen Umsetzung zu bekommen. Die Umsetzbarkeit von in vivo CAR-T-Zellgenerierung konnte bereits mit CD8 und CD4 Rezeptor-targetierten lentiviralen Vektoren (CD8-LV und CD4-LV) in präklinischen humanisierten Mausmodellen in früheren Studien der Arbeitsgruppe gezeigt werden. Allerdings haben sich diese Studien nur auf humanisierte Mausmodelle beschränkt, die nur bedingt den physiologischen Anteil von myeloiden Zellen im Menschen darstellen. Deswegen wurde in dieser Arbeit das CD34+ Stammzell-humanisierte NSG-SGM3 (huSGM3) Mausmodell verwendet, das einen bedeutenden Anteil an humanen angeborenen Immunzellen, vor allem Monozyten und Makrophagen, im System entwickelt, um in vivo CAR-T-Zellgenerierung zu untersuchen. Intravenöse (i.v.) Injektion von CD4-LV, CD8-LV oder eine Mischung von beiden Vektorarten führte zur erfolgreichen Generierung von CD19-CAR-T-Zellen im Blut von einigen Mäusen. Bedeutenswert war hierbei die spezifische CAR Expression in den jeweilig targetierten CD4 oder CD8 T-Zellsubtyp, ohne bemerkbare unspezifische Transduktion anderer Zelltypen. Die Reduktion von CD19+ Zielzellen im Körper unterstrich die Präsenz von funktionalen CD19-CAR-T-Zellen im peripheren System aber auch in verschiedenen lymphozytenreichen und biodistributionsrelevanten Organen. Weiterhin zeigte die Expansion von CAR-T-Zellen in der Zellkultur in der Gegenwart von Tumorantigen die Präsenz und lange Persistenz von in vivo generierten CART-Zellen in der Milz von einigen Mäusen. Außerdem konnte eine erfolgreiche Transgenintegration mittels qPCR-Analyse bestätigt werden. Im Allgemeinen war die Effizienz für in vivo CAR-T-Zellgenerierung in huSGM3 Mäusen jedoch geringer verglichen zu vorhanden Daten in CD34+ Stammzell-humanisierten NSG Mäusen. Überraschend war insbesondere die geringe in vivo CAR-T-Zellgenerierungseffizienz in CD4-LV injizierten Mäusen. Dies korrelierte zudem mit einem typischen Zytokinmuster für aktivierte humane myeloide Zellen im Plasma dieser Tiere. Eine reduzierte in vitro Transduktion von T-Zellen mit CD4-LV und CD8-LV in der Präsenz von Monozyten oder Makrophagen identifizierte diese Zellen als potenzielles Hindernis für in vivo CAR-T-Zellgenerierung. Bemerkenswert war, dass die Abschirmung der CD4-LV und CD8-LV vor Phagozytose, durch die Nutzung von ß2M-/-, CD47high HEK-293T Verpackungszellen für die Vektorpartikelproduktion, die CAR-T-Zellgenerierung in der Ko-kultur wesentlich verbesserte. Des Weiteren konnten diese Modifikationen die in vivo CAR-T-Zellgenerierung in huSGM3 Mäusen im Vergleich zu den konventionellen CD4-LV und CD8-LV verbessern. Das zeigte sich in höheren Vektorintegrationszahlen und ausgeprägteren CD19+ Zellreduktionen in der Milz und Knochenmark für beide abgeschirmte Vektorarten und zusätzlich auch in höheren CAR-T-Zellzahlen im Blut für abgeschirmte CD4-LV. Die Reduzierung der ex vivo Produktionszeit von CAR-T-Zellen ist ein anderer Weg, um das Herstellungsverfahren zu verbessern. In dieser Arbeit wurden CD19-CAR-T-Zellen, die innerhalb von 3 Tagen mittels lentiviraler Vektorinkubation hergestellt wurden (Kurzzeit-CAR-T-Zellen), auf ihre Zellkomposition untersucht und deren Potential das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) auszulösen, welches eine häufig auftretende Nebenwirkung in der CAR-T-Zelltherapie ist. Die Charakterisierung der Kurzzeit-CAR-T-Zellen nach der Produktion zeigte, dass die meisten Zellen Vektorpartikel gebunden haben, jedoch nur ein geringer Anteil der Zellen positiv für das CAR war. In einem eigens konzipierten Ko-kultur-Model mit Tumorzellen und Monozyten konnte die anti-tumorale Aktivität von den Kurzzeit-CAR-T-Zellen nachgewiesen werden, die bereits nach 24h der Ko-kultur erhebliche CAR Expression zeigten. Des Weiteren wurde eine hohe Ausschüttung von CRS-relevanten Zytokinen mitunter IL-6, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, IL-2 und IL-10 während der Ko-Kultivierung gemessen. Abschließende Evaluierung der Kurzzeit-CAR-T-Zellen in NSG-SGM3 Mäusen mit hoher Tumorlast zeigte nach i.v. Verabreichung einer hohen Zelldosis schwerwiegende akute Nebenwirkungen innerhalb der ersten 24 Stunden. Dazu zählten körperliche Krankheitszeichen, Temperatur- und Gewichtsverlust, sowie systemisch erhöhte Zytokine für humanes IFN- γ, TNF-α, IL-2 and IL-10 durch die Kurzzeit-CAR-T-Zellen und murines MCP-1, IL-6 and G-CSF durch das Maussystem. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit das Potential von komplexen Modelsystemen mögliche Hürden und Sicherheitsrisiken von neuartigen Herstellungsansätzen von CAR-T-Zelltherapie zu erforschen. Sie ermöglichten die Identifizierung von humanen Monozyten und Makrophagen als potentielle Barriere für in vivo CAR-T-Zellgenerierung und legen die Implementierung von Phagozytoseabschirmung in targetierten LVs nah, um die angeborene Immunantworten in einem solchen Ansatz zu reduzieren. Des Weiteren zeigten diese Modelsysteme das mögliche Risiko auf, dass Kurzzeit-CAR-T-Zellen schwerwiegendes akutes CRS auslösen können und halten zu einem vorsichtigen Angehen in der Klinik an und weiteren Untersuchungen mit diesen Modellplattformen.

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-230093
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Systems Biology of the Stress Response
Hinterlegungsdatum: 03 Feb 2023 13:06
Letzte Änderung: 06 Feb 2023 06:44
PPN:
Referenten: Löwer, Prof. Dr. Alexander ; Buchholz, Prof. Dr. Christian
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 15 Dezember 2022
Export:
Suche nach Titel in: TUfind oder in Google
Frage zum Eintrag Frage zum Eintrag

Optionen (nur für Redakteure)
Redaktionelle Details anzeigen Redaktionelle Details anzeigen
OAI 2.0-Basis-URL: https://tubiblio.ulb.tu-darmstadt.de/cgi/oai2 TUbiblio verwendet EPrints 3.
Drucken | Impressum | Datenschutzerklärung