Seit Jahrtausenden wird Cannabis in diversen Kulturen aufgrund ihrer vielseitigen Anwendungsmöglichkeiten genutzt. So diente die Pflanze unter anderem als Quelle für Textilfasern, fand aber auch als Arzneimittel zur Behandlung von Entzündungen, Krämpfen oder Epilepsie Verwendung. Mit der Entdeckung des Endocannabinoid-Systems erlangte die Pflanze, die Mitte des 20. Jahrhunderts wegen ihres übermäßigen Gebrauchs als Freizeitdroge in Verruf geraten war und bis heute in den meisten Ländern starken Restriktionen unterliegt, neues Ansehen. So fand man heraus, dass bestimmte Sekundärmetabolite, sogenannte Cannabinoide, eine Vielzahl von physiologischen Prozessen modulieren konnten und somit potentiell neue therapeutische Anwendungsmöglichkeiten eröffneten. Bis heute wurden mehr als 100 dieser Cannabinoide isoliert, von welchen die bekanntesten das psychoaktiv-wirkende Δ9 Tetrahydrocannabinol (THC) und das nicht-psychotrope Cannabidiol (CBD) darstellen. In diesem Zusammenhang finden die bereits als Arzneimittel zugelassenen THC- und CBD-haltigen Produkte wie Sativex® und Epidyolex® Anwendung in der Medizin. Allerdings gilt THC aufgrund seines psychoaktiven Charakters als große Einschränkung für den klinischen Einsatz, weshalb nicht-psychotrope Cannabinoide sowie synthetische, nicht natürlich-vorkommende Cannabinoide, die ähnliche medizinische Eigenschaften wie THC aufweisen, aber nicht die unerwünschte Nebenwirkung haben, in Zukunft von zentraler Bedeutung sein werden. Da die chemische Produktion synthetischer Cannabinoide jedoch sehr kostspielig ist, könnte die heterologe Produktion in Wirtsorganismen Abhilfe schaffen und möglicherweise zu einer Produktion seltener Phytocannabinoide oder neuartiger synthetischer Cannabinoid-Pharmazeutika im industriellen Maßstab führen, die durch den reinen Gebrauch von Cannabispflanzen nicht ohne weiteres zu Verfügung stehen. Im Hinblick darauf sollte Tabak als potentielle Produktionsplattform für die biosynthetische Herstellung von Cannabinoiden etabliert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass es möglich war alle an der Cannabinoid-Biosynthese beteiligten Enzyme in transient transformierten Tabakpflanzen zu produzieren und deren Aktivität in vitro nachzuweisen. Darüber hinaus führte die transiente Expression von aae1, ols und oac und die Supplementierung von Hexansäure in vivo sowohl zur Bildung des Cannabinoid-Vorläufermoleküls Olivetolsäure (OA) als auch zur Bildung des neuartigen C 4 OA-Glukosids. Über die Synthese von OA hinaus war es jedoch nicht möglich, den Biosyntheseweg in vivo zu rekonstruieren, was wahrscheinlich auf das Fehlen einer ausreichenden Versorgung mit Geranyldiphosphat (GPP) innerhalb der Pflanze zurückzuführen ist. Um zukünftig eine effiziente Produktion von Cannabinoiden zu ermöglichen, ist es daher essentiell diesen Engpass im Biosyntheseweg zu beseitigen. Zusätzlich zum transienten Ansatz sollten zudem stabil transformierte Flüssigzellkulturen generiert werden, welche die notwendigen Gene für die Produktion von OA oder dessen Glukosid exprimierten. Dies sollte im Hinblick auf einen Einsatz in der industriellen Produktion, eine großtechnische Kultivierung in Bioreaktoren unter GMP-Bedingungen ermöglichen. Im Gegensatz zur transienten Expression konnte jedoch weder die Synthese von OA noch dessen Glukosid nachgewiesen werden, was höchstwahrscheinlich einer Mutation im genutzten OLS-Gen zuzuschreiben ist. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung der Cannabionid-bildenden Synthasen Δ9 Tetrahydrocannabinolsäure-Synthase (THCAS), Cannabichromensäure-Synthase (CBCAS) und Cannabidiolsäure-Synthase (CBDAS). Dabei stellte sich heraus, dass für die Produktion der Enzyme in planta eine N-Glykosylierung und damit verbunden eine Lokalisation der Proteine über den sekretorischen Weg, entweder in den Apoplasten oder die Vakuole, vonnöten ist. Zudem zeigte sich in in vitro Versuchen mit THCAS und CBDAS, dass sich unter Zugabe von organischen Lösemitteln wie Acetonitril oder Aceton, die Produktspezifität der Enzyme von Δ9 Tetrahydrocannabinolsäure (THCA) beziehungsweise Cannabidiolsäure (CBDA) hin zur Synthese von Cannabichromensäure (CBCA) änderte. Dies wiederrum könnte darauf hindeuten, dass unter anderem die hydrophobe Umgebung in den Drüsentrichomen von Cannabis für die Cannabinoid-Diversität in verschiedenen Cannabis Varietäten verantwortlich ist. Da die CBCAS eine Aminosäure-Identität von 93 % gegenüber der THCAS aufweist, jedoch kein THCA produziert, liegt es nahe, dass kleine Unterschiede in der Aminosäuresequenz außerhalb des katalytischen Zentrums die Zyklisierungsspezifitäten beeinflussen. Daher wurden abschließend Mutagenese-Studien mit CBCAS und dem Ziel THCA zu produzieren, durchgeführt, um weitere Einblicke in die katalytischen Mechanismen der Synthasen erhalten. Allerdings führte keine der eingeführten Mutationen zur Produktion des gewünschten Cannabinoids, weshalb in Zukunft weitere ortsgerichtete Mutagenesen durchgeführt werden müssen, die auch die zunächst vernachlässigten Aminosäuren mit einschließen.