Cucu, Bayram (2018)
Endocytose und Exocytose in Saccharomyces cerevisiae.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

In der vorliegenden Arbeit wurden endocytotische und exocytotische Aktivität in Hefeprotoplasten mit Hilfe der Patch-Clamp Methode untersucht. Eine Variante dieser Methode erlaubt es, Änderungen der Membranfläche wie sie aus individuellen Ereignissen der Vesikelfusion oder Vesikelabschnürung resultieren, als Änderung der Membrankapazität mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu untersuchen. Die Kapazitätsmessungen werden dabei an kleinen Membranarealen durchgeführt. Dies erlaubt Einzelereignisse zu registrieren, wobei die Auflösungsgrenze in den hier vorgestellten Messungen im Bereich von etwa 0,1 fF lag. Dies entspricht einer Vesikelgröße von etwa 60 nm und würde damit ausreichen, um die Abschnürung von Clathrin-umhüllten Vesikel, die eine Größe von 50 -100 nm aufweisen, gerade noch zu erfassen. In Protoplasten von Wildtyp Hefezellen konnten exocytotische Ereignisse als Kapazitätserhöhungen mit einer mittleren Größe (Median) von 0,4 fF und endocytotische Ereignisse als Kapazitätserniedrigungen von 0,36 fF gemessen werden. Dies entspricht Durchmessern von 126 nm für sekretorische Vesikel und 120 nm für endocytotische Vesikel. Hefeprotoplasten wachsen in osmotisch stabilisierendem Puffer mit Glucose als Kohlenstoffquelle kontinuierlich über mehrere Tage, ohne Knospen zu bilden und sich vegetativ zu vermehren. Dies ist konsistent mit der Beobachtung, dass in Protoplasten von Wildtypzellen ein leichtes Ungleichgewicht zugunsten exocytotischer Aktivität (fex) gegenüber endocytotischer Aktivität (fend) von fex/fend = 1,6 herrscht. Dieses leichte Ungleichgewicht war in Clathrin-Deletionsmutanten gestört. Während die Deletion des Gens für die schwere Clathrinkette, CHC1, zu einer leichten Inhibierung der Endocytose führte, kam die endocytotische Aktivität in CLC1-Deletionsmutanten fast vollständig zum Erliegen. Das Verhältnis fex/fend stieg in der CHC1-Deletionsmutante auf 2,6 und in der CLC1-Deletonsmutante auf 21,0. Dies resultierte in einer Steigerung des Protoplastenwachstums gegenüber Protoplasten aus Wildtypzellen, wobei der positive Effekt auf das Wachstum der Protoplasten aus der CLC1-Deletionsmutante deutlich stärker war, als das der Protoplasten aus der CHC1-Deletionsmutante. Offensichtlich ist die endocytotische Aktivität in der Bäckerhefe sehr viel stärker von Clc1p abhängig, als von Chc1p. Der Grund dafür könnte in der Funktion von Clc1p als regulatorisches Element für die Trimerisierung von Chc1p und somit für die Bildung des Clathrinmantels und in seiner Funktion als Bindeglied für die Anheftung von Actin an die Membran liegen. Actin fungiert als treibende Kraft für die Membraninvagination und Ablösung von endocytotischen Vesikeln. Neben den Strukturproteinen Clc1p und Chc1p, die das Clathringerüst bilden, konnte die Lipidzusammensetzung der Membran als wichtiger Faktor für die exocytotische und endocytotische Aktivität in der Bäckerhefe identifiziert werden. Um die Rolle von Lipiden bei Endo- und Exocytose zu untersuchen, wurden Hefestämme verwendet, in denen die Expression von Schlüsselenzymen des Lipidstoffwechsels reguliert werden konnte. Durch Austausch des POLE1-Promotors gegen den Methionin-reprimierbaren PMET3-Promotor war es möglich durch Reprimierung der OLE1-Expression den Gehalt an einfach-ungesättigten Fettsäuren in Hefe von 80% auf 25% zu reduzieren. Die Reduzierung des Anteils einfach-ungesättigter Fettsäuren resultiert in einer Verringerung der Membranfluidität und in einer Reduzierung der exocytotischen und endocytotischen Aktivität, wobei der inhibitorische Effekt auf die endocytotische Aktivität stärker war, als auf die exocytotische Aktivität. Durch diese Reduzierung der Membranfluidität wurde 85% der endocytotischen Aktivität gehemmt. Nicht nur der Anteil ungesättigter Fettsäuren in der Membran spielt eine Rolle für endocytotische und exocytotische Aktivität, sondern auch die Dotierung der Membran mit Sterolen, wobei dies in Hefe vorwiegend Ergosterol ist. Hemmung der Ergosterolbiosynthese in einem Hefestamm mit regulierbarer Expression von ERG9 führte zu einer Halbierung der endocytotischen Aktivität, während dies keinen Einfluss auf die exocytotische Aktivität hatte. Hier stellte sich die Frage, ob die Hemmung der endocytotischen Aktivität auf eine Änderung der Membranfluidität oder auf die Auflösung von Lipid Rafts, die als Orte der Endocytose diskutiert werden, zurückzuführen ist. Die in elektrophysiologischen Experimenten gemessenen Änderungen der endocytotischen und exocytotischen Aktivitäten in Abhängigkeit der Lipidkomposition (ungesättigte Fettsäuren und Ergosterol-Gehalt) konnten durch fluoreszenz-optische Experimente bestätigt werden. Dabei wurde die Expression und Plasmamembran-Lokalisation eines GFP-Fusionsproteins (Tok1p-GFP) als Indiz für korrekte Exocytose und die Internalisierung des lipophilen Farbstoffs FM4-64 als Endocytosemarker verwendet.

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