Zell-basierte High-Content-Screenings (HCS) verwenden zumeist als Monolayer kultivierte 2D Zellen [1]. Dieses Zellkultursystem ist hoch artifiziell, da es mehrere wichtige Aspekte nicht ausreichend nachstellt: (i) 2D kultivierten Zellen fehlt es an Dimensionalität, (ii) es ist ein stark polarisiertes, mechanobiologisches System und (iii) lokale Konzentrationsunterschiede molekularer Gradienten existieren nicht. Im Gegensatz zu dieser klassischen Zellkulturtechnik ahmen sogenannte 3D Zellkultursysteme die in vivo Eigenschaften der natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) in Form von z.B. Hydrogelen oder Sphäroidkulturen nach [2]. Hierbei werden physikalische, (bio)chemische und mechanische Eigenschaften berücksichtigt [3, 4]. Zellen, die in einem 3D Zellkultursystem kultiviert werden, weisen im Vergleich zu 2D kultivierten Zellen, unter Anderem eine unterschiedliche Morphologie, Proliferations- und Migrationsrate auf [5, 6, 7]. Auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von 3D Zellkultur basierten Versuchen auf z.B. exprimierte Tumormarker oder medikamentöse Behandlungen, ist deutlich erhöht [9, 8, 10]. Im Gegensatz zu der Standard 2D Zellkultur haben 3D kultivierte Zellen die Möglichkeit mit der ECM zu interagieren [26]. Diese Interaktionen finden durch Signalprozesse an der Plasmamembran statt, wodurch viele Prozesse wie Migration, Proliferation, Differenzierung und Zellüberleben reguliert werden [11, 12, 13]. Integrine sind hierbei die Hauptvermittler der Zell-ECM Interaktion. Dieser Prozess ist besonders interessant, da er im direkten Zusammenhang mit der cell-adhesion-mediated-radio-reistance (CAM-RR) steht, die nur für Zellen beobachtet werden kann, die in 3D kultiviert werden [27]. Bis zu Beginn dieser Thesis wurde die CAM-RR mit Chromatinstrukturen, die sich zwischen 2D und 3D kultivierten Zellen unterschieden, in Zusammenhang gebracht. Hierbei führt ein erhöter Anteil an He- terochromatin von 3D kultivierten Zellen zu einer geringeren Menge an Doppelstrangbrüchen nach einer Bestrahlung mit Röntgenstrahlen. Zum Anderem wurde dieser Prozess mit ECM-bindenden Integrinen, welche eine β1 Untereinheit besitzen, in Verbindung gesetzt [14]. Ziel des ersten Kapitels dieser Arbeit war es, die an der Plasmamembran lokalisierten Effekte ionisierter Strahlung auf β1 Integrine zu untersuchen. Hierfür wurden 3D kultivierte Zellen mit Röntgenstrahlen bestrahlt und die nanoskalige Verteilung der Integrincluster mittels Einzelmolekülmikroskopie untersucht und anschließend quantifiziert. Durch Vergleichsexperimente mit 2D kultivierten Zellen konnte gezeigt werden, dass die Strahlenresistenz der 3D kultivierten Zellen auf ihrer Fähigkeit beruht, Integrincluster besser zu organisieren. Im Gegensatz zu 3D Zellen, weisen 2D kultivierte Zellen eine dynamische und instabile Clusterung der Integrine auf. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Signalweiterleitung mittels Integrinen in 2D kultivierten Zellen fehlerhaft ist. Demnach konnte gezeigt werden, dass stabile Integrincluster 3D kultivierter Zellen zu einer Strahlenresistenz, dynamische und instabile Cluster 2D kultivierter Zellen hingegen zu einer Strahlensensitivität führen. Im zweiten Kapitel dieser Arbeit wurde der Integrininhibitor AIIB2 verwendet um die Integrincluster 3D kultivierter Zellen zu destabilisieren und so, in einem kombinierten Ansatz aus Inhibitor und Be- strahlung, eine Strahlensensitiviät zu induzieren. Integrine sind nicht nur für die Zell-ECM Interaktion verantwortlich. Durch eine physikalische Verbindung (u.A. Aktin, die Kernmembranproteine Nesprin und SUN) sind sie mit der nuklearen Lamina verbunden und können so die Chromatinverteilung beeinflus- sen. Durch das Folgen der mechanobiologischen Verbindung zwischen Integrinen und Nukleus konnte nachgewiesen werden, dass die CAM-RR 3D kultivierter Zellen auf ein funktionierendes, ausbalanciertes Mechanoperzeptions-System mit seinem Ursprung in einer korrekten Integrinclusterung beruht. Hingegen besitzen 2D kultivierte Zellen ein nicht funktionsfähiges, artifiziell versteiftes mechanobiologisches System. iii Das dritte Kapitel dieser Dissertation beantwortet die Frage, ob die membranlokalisierten Effekte der Röntgenstrahlung auf das Integrinclustering Lipid-raft abhängig sind. Hierbei wird zudem die ge- neralisierte Abhängigkeit zwischen Raft- und gleichzeitiger Proteinlokalisierung hinterfragt. Integrine und Cholesterolmikrodomänen kolokalisieren, eine Bestrahlung mit einer hohen Dosis ionisierender Strahlung ist jedoch in der Lage Integrine aus diesem System herrauszulösen, während Cholesterolrafts durch die Bestrahlung nicht beeinflusst werden. Dies zeigt, dass (i) die Effekt der ionisierenden Strahlung auf Integrine Lipid-raft unabhängig sind, aber auch, dass (ii) die Kolokalisierung beider Mikrodomänen womöglich voneinander unabhängig sind. Schlussendlich, nur durch einen kombinierten, methodischen Ansatz aus 3D Zellkultur und Einzelmo- lekülmikroskopie war es möglich das Integrinclustering als Target für die Induzierung der Strahlensen- sitivität zu identifizieren. Hierbei ist das durch Einzelmolekülmikroskopie bestimmte Proteinclustering eine erweiterte Form des molekularen Phenotyps, welcher sonst z.B. Proteinaktivitäten beschreibt. Durch die Implementierung der Einzelmolekülmikroskopie und der 3D Zellkultur in ein Phenotyp-basiertes HCS könnten die Vorteile beider Methoden die Aussagekraft solch eines Scrennings bereichern: (i) 3D Zellkulturen spiegeln den in-vivo exprimierten Phenotyp wieder und (ii) Einzelmolekülmikroskopie würde es ermöglich den molekularen Phenotyp zu bestimmen und den Einfluss möglicher Leitstrukturen auf die nanoskalige Verteilung eines Targets zu quantifizieren. Trotz dieser Vorteile basieren vorklinische Screenings zumeist auf artifiziellen 2D Zellkulturen und auf mikroskopischen Methoden, die eine deutlich geringere Auflösung aufweisen.