Fuck, Sebastian (2017)
Kurz- und Langzeiteffekte ionisierender Strahlung auf die T-Zelllinie Jurkat.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die schädigende Wirkung ionisierender Strahlung auf humane Zellen ist seit Jahrzehnten bekannt und wird besonders in der Strahlentherapie genutzt um gezielt Tumore abzutöten. Neben der gezielten Bestrahlung des Tumorgewebes wird auch immer gesundes Gewebe bestrahlt. Die Auswirkungen dieser subletalen Dosen sind weniger gut erforscht. Die Strahlenhormesis beschreibt Prozesse bei denen geringe Strahlendosen sogar positive Effekte auf Zellen haben können. Besonders Immunzellen scheinen durch die Strahlung angeregt zu werden, da sie nach einer Bestrahlung Tumorgewebe effizienter bekämpfen können (Liu 2006). Im Zusammenhang mit der Immuntherapie ist die Wirkung der Bestrahlung auf Immunzellen von fundamentaler Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird eine strahleninduzierte Veränderung des Aktivierungszustands der Leukämie T-Zelllinie Jurkat mit den zugrundeliegenden Signalkaskaden untersucht. Eine Bestrahlung von Jurkat Zellen führt zu einer deutlichen morphologischen Änderung und einem veränderten Expressionslevel eines Markers, der für die Aktivierung von T-Zellen charakteristisch ist. In Abhängigkeit von der Dosis vergrößert sich der Zelldurchmesser 48 h nach Bestrahlung. Die Expression von Interleukin-2, einem Zytokin, das bei der normalen Immunantwort infolge einer Aktivierung exprimiert wird, wird hochreguliert. Strahlung bewirkt keine Veränderung der Expression von RNF-128, einem Protein, das T-Zellen exprimieren, wenn sie in den inaktiven Zustand der Anergie wechseln. Obwohl Interleukin-2 hochreguliert wird, konnte keine Zunahme der CD25 Expression nach Bestrahlung beobachtet werden. CD25 wird nur nach einer vollständigen Aktivierung durch Antigen und Costimulus produziert. Die Vermutung, dass eine Signalkaskade über ROS und Calcium, die in vorausgehenden Arbeiten beschrieben wurde, für diese Aktivierung verantwortlich ist, konnte nicht vollends als Ursache bestätigt werden. Mit dem genetisch kodierten H2O2 Sensor HyPer konnte mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gezeigt werden, dass ionisierende Strahlung das ROS Level in Jurkat Zellen erhöht, wobei die Zellen jedoch einen sehr großen Bereich an H2O2 Änderungen zeigten. Wenn ein Anstieg an H2O2 durch in den Zellen durch extern appliziertes H2O2 nachgeahmt wurde, erhöhte sich die intrazelluläre Calciumkonzentration in einer charakteristischen oszillierenden Art und Weise, die auf einen Calcium induzierte Calcium Freisetzung als Signalantwort schließen lässt. In direkten Messungen der Calciumkonzentration in bestrahlten Jurkat Zellen war es jedoch nicht möglich mit dem chemischen Calciumsensor Fluo-4 eine direkte Auswirkung der Strahlung auf die intrazelluläre Calciumkonzentration innerhalb von wenigen Minuten nach Zusammenfassung 5 Bestrahlung nachzuweisen. Während diese Daten andeuten, dass Calcium keine Rolle in der frühen Reaktion von Zellen auf Strahlung spielt, so zeigen anderen Daten, dass dieser second messenger in späteren Reaktionen beteiligt ist. Mit dem Calciumchelator war es möglich eine strahleninduzierte Vergrößerung der Jurkat Zellen gänzlich zu verhindern. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass eine verzögerte Auswirkung des Calciums eine Rolle in dem Prozess der Zellvergrößerung hat. Ein Abfangen der nach Strahlung entstandenen ROS durch ROS scavenger hatte keinen Effekt auf die Vergrößerung. Eine Rolle der ROS für eine Aktivierung konnte ungeachtet dessen durch eine 10 minütige Behandlung mit H2O2 gezeigt werden; in dem Fall ersetzt eine kurze Inkubation der Zellen in H2O2 die Strahlenexposition. Die Versuche zeigen, dass H2O2 zu einer konzentrationsabhängigen Vergrößerung der Zellen führt, die in ihrem Maximum halb so stark wie die maximale Vergrößerung nach einer Bestrahlung war. Eine Vergrößerung in gleichem Maße wie nach einer Behandlung mit H2O2 konnte durch den G2-Zellzyklus Inhibitor RO3306 erreicht werden. Zusammen führen diese Daten zur Hypothese, dass 50 % der Vergrößerung der Jurkat Zellen nach Bestrahlung auf eine Signalkaskade über ROS zustande kommen und die übrigen 50 % aus einem G2- Zellzyklussarrest resultieren. In Kontrollversuchen hatte sich gezeigt, dass die entsprechenden H2O2 Behandlung keinen Einfluss auf einen G2-Zellzyklusarrest haben. Für die Aktivierung von Jurkat Zellen kommt hingegen eine Signalkaskade infrage, die auch durch ROS induzierbar ist, da kein Zusammenhang zwischen einem G2-Arrest und einer veränderten Transkription oder Aktivierung von T-Zellen bekannt ist. Proteine der DNA Reparatur gehören zu den Proteinen, die unmittelbar auf die Bestrahlung reagieren können. Sie sind nicht nur in der Lage DNA-Schäden zu reparieren, sondern können überdies Zellen im Zellzyklus arretieren. Proteine der DNA Reparatur wurden als Auslöser der Aktivierung und Vergrößerung vermutet. Daher wurden DSB Reparaturproteine durch Inhibitoren inaktiviert. Die Inhibition des Reparaturproteins ATR hatten nicht nur zur Folge, dass die strahleninduzierte Vergrößerung verhindert wurde, sondern auch die Arretierung im Zellzyklus teilweise aufgehoben wurde. Letzteres äußerte sich dadurch, dass Jurkat Zellen selbst nach einer Strahlendosis, die ausreicht um einen kompletten Zellzyklusarrest zu initiieren, weiter proliferierten. Dies führt zur Hypothese, dass ionisierende Strahlung durch direkte und indirekte Effekte einzelsträngige Bereiche der DNA erzeugt, wodurch ATR rekrutiert wird, das einerseits einen Zellzyklusarrest initiiert und andererseits eine Vergrößerung und Aktivierung der Jurkat Zellen über zytosolische Signalmoleküle bewirkt. Die Bedeutung des Reparaturproteins ATR für das Zellschicksal ist folglich größer als bisher angenommen. ATR könnte daher das zentrale Protein sein, das für positive Effekte im Zuge der Strahlenhormesis sorgt.

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