Haase, Doreen (2017)
Epsilonproteobakterielle Hydroxylamin-Oxidoreduktase (εHao): Charakterisierung eines “missing links“ innerhalb der Multihäm Cytochrom c Familie.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Familie der prokaryotischen Multihäm Cytochrome c (MCC) besitzt eine zentrale Rolle im biogeochemischen Stickstoffkreislauf. Zwei bedeutende Multihäm Cytochrome c, die am Umsatz von Stickstoffverbindungen beteiligt sind, sind die Pentahäm Cytochrom c Nitritreduktase (NrfA) und die Oktahäm Hydroxylamin-Oxidoreduktase (Hao). Die Nitritreduktase ist dabei in den anaeroben Stoffwechselprozess der Ammonifikation involviert wohingegen die Hydroxylamin-Oxidoreduktase an dem aeroben Prozess der Nitrifikation beteiligt ist. Vertreter der MCC-Familie weisen zumeist einen vielseitigen enzymatischen Charakter auf. Ein prominentes Beispiel hierfür ist die Nitritreduktase (NrfA), welche neben der Nitrit- und Hydroxylamin-Reduktion zu Ammonium ebenfalls die Detoxifikation reaktiver Stickstoff-Spezies katalysiert. Die Oktahäm Cytochrom c Hydroxylamin-Oxidoreduktasen (fakultativ) anaerober Nitrat-Ammonifizierer (εHao) sind ebenfalls der MCC-Familie zugehörig. Strukturell weisen εHao-Proteine Identitäten von bis zu 22 % zur Hydroxylamin-Oxidoreduktase der nitrifizierenden Bakterien auf. Epsilonproteobakterielle Hydroxylamin-Oxidoreduktasen (εHao), die in den Genomen diverser Nitrat/Nitrit-Ammonifizierer identifiziert wurden, wurden jedoch bislang weder biochemisch noch enzymatisch charakterisiert. Interessant ist jedoch, dass diese Organismen bis auf wenige Ausnahmen kein Homolog der periplasmatischen Nitritreduktase NrfA besitzen. Aufgrund dessen wurde vermutet, dass die entsprechenden Bakterien über einen bisher nicht untersuchten Weg der Nitritverwertung verfügen. Weiterhin wurde angenommen, dass εHao-Proteine maßgeblich an diesem neuen Reaktionsweg beteiligt sein könnten. Die Ziele dieser Arbeit waren daher die heterologe Produktion diverser epsilonproteobakterieller Hydroxylamin-Oxidoreduktasen im Wirtsorganismus Wolinella succinogenes, die Reinigung der Proteine mittels Affinitätschromatographie und die ortsspezifische Mutagenese εHao-kodierender haoA-Gene. Weiterhin sollten die enzymatische Charakterisierung der Proteine unter Verwendung verschiedener Substrate sowie die Analyse des Substrat- und Produktspektrums erfolgen, um Rückschlüsse auf die biologische Funktion der epsilonproteobakteriellen Hydroxylamin-Oxidoreduktasen zu ziehen. Zusätzlich wurde das Vorkommen, die Lage der entsprechenden Gene im Genom sowie die strukturelle Diversität der Hydroxylamin-Oxidoreduktasen (εHao) mit Hilfe von bioinformatischen Analysen untersucht. Innerhalb dieser Arbeit wurden affinitätsmarkierte epsilonproteobakterielle Hydroxylamin-Oxidoreduktasen der wirtsassoziierten Epsilonproteobakterien Campylobacter fetus (CfHao) und Campylobacter curvus (CcuHao) sowie der Tiefsee-Bakterien Caminibacter mediatlanticus (CmHao) und Nautilia profundicola (NpHao) unter Verwendung des Expressionsplasmids pTMH heterolog als εHao-MBP (Maltose-Bindeprotein) Fusionsproteine in W. succinogenes produziert. Durch doppelt homologe Rekombination erfolgte der Austausch des nrfA Gens von W. succinogenesgegen die haoA Gene der oben aufgeführten Epsilonproteobakterien. Nachfolgend wurden die εHao-Proteine gereinigt und hinsichtlich ihrer Enzymaktivitäten im Vergleich zu bereits charakterisierten Enzymen (W. succinogenes NrfA; Nitrosomonas europaea Hao) untersucht. Innerhalb der Enzymaktivitätsmessungen wurden Nitrit, Hydroxylamin, Sulfit und Hydrazin als potenzielle Substrate verwendet. Bei allen vier charakterisierten Enzymen war die für Nitritreduktasen des NrfA-Typs charakteristische Katalyse von Nitrit und Hydroxylamin nachweisbar, wobei bei der Nitritreduktion Ammonium als Produkt gebildet wurde. Hinsichtlich der Hydroxylamin-Oxidation sowie Hydrazin- und Sulfit-Reduktion konnten hingegen keine signifikanten spezifischen Aktivitäten ermittelt werden. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die ortsspezifische Mutagenese von Genen, die für epsilonproteobakterielle Hydroxylamin-Oxidoreduktasen kodieren. εHao-Proteine besitzen im Gegensatz zur N. europaea Hao (NeHao) keinen Tyrosinrest im aktiven Zentrum, welcher für die Ausbildung eines Häm P460 essentiell ist. Dieses Häm P460 weist zwei kovalente Bindungen zwischen einem konservierten Tyrosin-Rest und der Häm c-Gruppe des aktiven Zentrums eines benachbarten Hao-Monomers auf. Es bedingt daher vermutlich die oxidative Funktion der NeHao und ist ursächlich für die Ausbildung einer homotrimeren Struktur, in der die einzelnen Untereinheiten kovalent miteinander verknüpft sind. Mittels Mutagenese der entsprechenden haoA-Gene wurde die Aminosäure Tyrosin an den zur NeHao äquivalenten Positionen in die Proteine CcuHao, CfHao und CmHao eingebracht. Nachfolgend wurden die Proteinvarianten hinsichtlich der Ausbildung eines Häm P460, einer Trimerisierung und der Enzymaktivität geprüft. Bei keiner der generierten εHao-Varianten war jedoch eine erhöhte Hydroxylamin-Oxidase-Aktivität oder ein für das Häm P460 charakteristisches Absorptionsmaximum bei 460 nm nachweisbar. Zusätzlich wurde eine bioinformatische Analyse von εHao-kodierenden haoA-Gensequenzen durchgeführt, die Aufschluss über das Vorkommen der haoA-Gene, deren Lage im Genom sowie mögliche Interaktionspartner geben sollte. Mit Hilfe von Sequenzvergleichen wurde ermittelt, dass 18 der insgesamt 40 identifizierten HaoA-Proteine der Klasse der Epsilonproteobakterien zugeordnet werden können. Allerdings wiesen auch die Genome diverser Gamma- und Deltaproteobakterien sowie Angehörige der Phyla Aquificae und Thermodesulfobacteria vorhergesagte HaoA-Proteine auf. Mit Hilfe der vorhandenen Genomdaten war es möglich, in einem Großteil der Organismen das Gen haoB nachzuweisen, welches für ein Tetrahäm Cytochrom c der NapC/NrfH-Familie kodiert und in vielen Fällen stromaufwärts des haoA-Gens gelegen ist. Dieses Resultat lässt die Ausbildung eines membrangebundenen HaoBA-Komplexes vermuten, der eine funktionelle Ähnlichkeit zu dem gut charakterisierten Nitritreduktase-Komplex NrfHA aufweisen sollte. Bedeutend ist hierbei, dass die beiden Tiefseebakterien C. mediatlanticus und N. profundicola als Nitrat-ammonifizierende Organismen beschrieben wurden, obwohl in deren Genomen keine Gene für die periplasmatische Nitritreduktase NrfA vorhanden sind. Somit ist der ammonifizierende Metabolismus dieser Bakterien durch das Vorhandensein von haoA- (und haoB-) Genen erklärbar. Aufgrund dessen besitzt die εHao in diesen Organismen vermutlich eine physiologische Rolle innerhalb der Nitrit-Respiration und/oder Nitrit-Assimilation. Weiterhin ist unter Einbeziehung der biochemischen Ergebnisse eine Funktion der Proteine im Rahmen der Hydroxylamin- und/oder NO-Detoxifizierung denkbar, was den vielseitigen metabolischen Charakter von Vertretern der MCC-Familie unterstreicht. Die konservierte Anordnung der Häm-Gruppen, die Sequenzhomologie zur Hao sowie die mögliche funktionelle Ähnlichkeit zu NrfA-Proteinen lassen die Hypothese zu, dass εHao-Proteine möglicherweise eine bedeutende Rolle als “missing link“ innerhalb der Evolution von NrfA- und Hao-Enzymen einnehmen.

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