Krämer, Andreas (2017)
Strukturelle Untersuchung Histon-Deacetylase-ähnlicher Enzyme aus Pseudomonas aeruginosa.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

In der vorliegenden Arbeit wurden die drei Enzyme PA0321, PA1409 und PA3774 aus dem Humanpathogen Pseudomonas aeruginosa untersucht. Alle drei Enzyme gehören zur Histon-Deacetylase-Superfamilie (HDAC) und waren anhand von Sequenzanalysen als putative Acetylpolyamin-Aminohydrolasen (APAH) vorhergesagt. Das Hauptaugenmerk der Arbeit lag auf der strukturellen Aufklärung dieser Enzyme mithilfe der Kristallstrukturanalyse. Die daraus gewonnenen Informationen, sollten dazu dienen potente und selektive Inhibitoren zu entwickeln, da angenommen wurde, dass eine Inhibition dieser Enzyme dazu beitragen könnte, bakterielle Infektion besser zu bekämpfen. Eine enzymatische Analyse der Enzyme bestätigte die Vorhersage, dass es sich bei den Enzymen PA1409 und PA0321 um APAHs handelt. Im Gegensatz dazu zeigte das Enzym PA3774 keinen signifikanten Umsatz von acetylierten Polyaminen. Die hohen Umsatzraten von artifiziellen HDAC-Substraten lassen darauf schließen, dass acetylierte Proteine die eigentlichen Substrate dieses Enzyms sind. Im weiteren Verlauf gelang es die Struktur des Enzyms PA3774 aufzuklären. Neben der nativen Struktur konnten zusätzlich Enzym-Ligand-Komplexe in hoher Auflösung determiniert werden, die detaillierte Einblicke in das Bindungsverhalten der Liganden geben. Wie sich herausstellte, zeigt PA3774 eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit der Histon-Deacetylase-ähnlichen Amidohydrolase (FB188-HDAH) aus Bordetella/Alcaligenes und sollte treffender als HDAH anstatt als APAH klassifiziert werden. Zum besseren Verständnis und Vergleich dieser beiden Proteine wurde die Kristallisation der FB188-HDAH reproduziert und es konnten verschiedene neue Enzym-Ligand-Komplexe erhalten werden. Beide Enzyme zeigen eine analoge Tetramerisierung, deren spezifische Assemblierung den Bindungskanal entscheidend beeinflusst. Aufgrund dessen ist anzunehmen, dass diese Quartärstruktur eine essenzielle Funktion besitzt. Zwar gelang die Kristallisation von PA0321 und PA1409 im Rahmen dieser Arbeit nicht, jedoch ist die Struktur der eng verwandten APAH aus M. ramosa bereits bekannt. Ein Vergleich der HDAH und APAH Enzyme zeigt gravierende Unterschiede hinsichtlich ihrer Quartärstruktur, was eine plausible Erklärung für ihre unterschiedlichen Substratselektivitäten liefert. Zusätzlich wurden an zwei Nebenprojekten gearbeitet. Im Ersten wurden vielversprechende photoschaltbare Inhibitoren auf bakterielle sowie menschliche HDAC-Enzyme untersucht. Hierbei zeigten die Inhibitoren in ihrer metastabilen cis-Konfiguration eine um bis zu 10-fach erhöhte Wirkung Inhibition im Vergleich zur thermostabileren trans-Konfiguration. Solche photoschaltbaren Inhibitoren eröffnen einen Weg hin zu zielgerichteten nebenwirkungsärmeren Chemotherapien. In einem weiteren Nebenprojekt wurde ein neuartiger Fluoreszenzlebensdauer-Bindungs-Assay entwickelt, der es ermöglicht im Hochdurchsatzverfahren große Substanzbibliotheken zu testen und Inhibitoren für diese Enzymklasse zu finden. Darüber hinaus können Bindungskonstanten von Inhibitoren unabhängig von der Enzymaktivität bestimmt werden.

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