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Synthesis and in-depth analysis of natural and engineered cystine-knot miniproteins

Reinwarth, Michael (2017):
Synthesis and in-depth analysis of natural and engineered cystine-knot miniproteins.
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
[Ph.D. Thesis]

Abstract

In der hier vorgelgegten Arbeit wurde die Synthese und Analytik bekannter und sequenziell veränderter Varianten offenkettiger, inhibitorischer Miniproteine behandelt. Die Cysteinoxidation und der damit verbundenen Ausbildung sekundärer und tertiärer Strukturelemente von Mikroproteinen ist ein entscheidender Schritt der Synthese. Durch dessen Optimierung konnten mit hoher Ausbeute Cystinknoten verschiedener Aminosäuresequenzen synthetisiert werden. Daraus resultierend konnten neben Oligomerisierungen auch intensive kristallographische und massenspektrometrische Untersuchungen durchgeführt werden. Die aus der Kristallstruktur gewonnen Erkenntnisse konnten daraufhin zur Generierung einer Peptidbibliothek verwendet werden, die in hochaffine Binder gegen krebsrelevante Oberflächenenzyme resultierte. Ebenso ermöglichte die Optimierung der oxidativen Faltung die Synthese verschiedener Miniproteinvarianten und die damit verbunden enzymologischen und zellbiologischen Tests. Die komplexen, massenspektrometischen Nachweise der Disulfidtopologie der Miniproteine führte zu einem vereinfachten Nachweis hinsichtlich Cystinverknüpfungen künftiger Varianten und zeigte erstmals ein Fragmentierungsmuster, das sich abhängig von der Faltung eines Proteins verändert.

Item Type: Ph.D. Thesis
Erschienen: 2017
Creators: Reinwarth, Michael
Title: Synthesis and in-depth analysis of natural and engineered cystine-knot miniproteins
Language: English
Abstract:

In der hier vorgelgegten Arbeit wurde die Synthese und Analytik bekannter und sequenziell veränderter Varianten offenkettiger, inhibitorischer Miniproteine behandelt. Die Cysteinoxidation und der damit verbundenen Ausbildung sekundärer und tertiärer Strukturelemente von Mikroproteinen ist ein entscheidender Schritt der Synthese. Durch dessen Optimierung konnten mit hoher Ausbeute Cystinknoten verschiedener Aminosäuresequenzen synthetisiert werden. Daraus resultierend konnten neben Oligomerisierungen auch intensive kristallographische und massenspektrometrische Untersuchungen durchgeführt werden. Die aus der Kristallstruktur gewonnen Erkenntnisse konnten daraufhin zur Generierung einer Peptidbibliothek verwendet werden, die in hochaffine Binder gegen krebsrelevante Oberflächenenzyme resultierte. Ebenso ermöglichte die Optimierung der oxidativen Faltung die Synthese verschiedener Miniproteinvarianten und die damit verbunden enzymologischen und zellbiologischen Tests. Die komplexen, massenspektrometischen Nachweise der Disulfidtopologie der Miniproteine führte zu einem vereinfachten Nachweis hinsichtlich Cystinverknüpfungen künftiger Varianten und zeigte erstmals ein Fragmentierungsmuster, das sich abhängig von der Faltung eines Proteins verändert.

Place of Publication: Darmstadt
Uncontrolled Keywords: Peptid, Miniprotein, Cystin, Knoten, Cystein, Faltung, chemische Synthese, Massenspektrometrie, Strukturaufklärung, HPLC, MS, Matriptase, Bibliothek, Randomisierung, Biochemie
Divisions: 07 Department of Chemistry
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 26 Mar 2017 19:55
Official URL: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/6104
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-61046
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Schmitz, Prof. Dr. Katja
Refereed / Verteidigung / mdl. Prüfung: 11 July 2016
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Alternative keywordsLanguage
Peptide, Miniproteine, Cystine, Knot, Cysteine, Folding, chemical Synthesis, Mass spectrometry, structural investigation, HPLC, MS, Matriptase, library, Randomization, BiochemistryEnglish
Alternative Abstract:
Alternative abstract Language

In the present work, synthesis and analytic of wildtype and sequentially altered variants of open-chain inhibitor cystine-knots are presented. Oxidation of cysteines and the related formation of secondary and tertiary structural elements is the yield-determining step. Through the optimization of this step, cysteine-knot miniproteins of multiple amino acid sequences could be synthesized. From that, beside oligomerization reactions, crystallographic and mass spectrometric investigations were achieved. Structural insights originating from crystal structure, were used for generation of a peptide library which resulted in highly affine binders against tumor-related Matriptase-1. Moreover, optimization of oxidative folding enabled enzymological and cell biological tests. The complex, mass spectrometric investigations, led to a simplified verification of cystine topology regarding future variants and showed a fragmentation pattern which was closely related to the folding state of the peptides.

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