Uth, Christina (2016)
Development of bioorthogonal synthetic strategies towards hybrid macromolecular conjugates with tailored properties.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Über die letzten Jahrzehnte wurde eine große Anzahl von chemischen Reaktionen entwickelt, die kompatibel mit bioinspirierten, biotechnologischen und biomimetischen Molekülen sind und den gegenwärtigen Anforderungen des kontinuierlich wachsenden Repertoires von Konjugationstechniken entsprechen. Die Wahl des geeigneten Ansatzes aus der Toolbox der sogenannten bioorthogonalen Methoden ist allerdings immer einzelfallabhängig. Das zentrale Ziel der vorgestellten kumulativen Arbeit war deshalb die Konzeption und Entwicklung von neuen kombinierten „orthogonalen bioorthogonalen“[1] Synthesestrategien, d.h. die Entwicklung von bestimmten chemo- und regioselektiven Reaktionen für die Synthese von makromolekularen Konjugaten mit maßgeschneiderten Eigenschaften. Dazu wurde eine Vielzahl von Verbindungen aus verschiedenen molekularen Klassen untersucht, darunter kleine Zytotoxine und Oligopeptide, hoch geordnete kubisch-oktamerische Silsesquioxane (COSS), kristalline Nanocellulose und funktionelle Proteine. Für jedes, in dieser Arbeit beschriebene Konjugat wurde eine individuelle bioorthogonale Synthesestrategie entwickelt, die die intrinsischen Eigenschaften, speziellen Anforderungen und verschiedenen Restriktionen der jeweiligen Reaktionspartner berücksichtigt. Um eine tragfähige und reproduzierbare Syntheseplattform zu etablieren, wurden drei eigenständige Studien durchgeführt, die jeweils eine Reihe von selektiven chemischen Reaktionen zwischen speziellen funktionellen Molekülen mit den jeweiligen Gegenstücken enthielten. Unter Berücksichtigung, dass Bio-(makro)moleküle sehr komplex und vielfältig sind, sollte der Konjugationsansatz die erforderliche Bioorthogonalität, sowie Flexibilität hinsichtlich Effizienz, Erschwinglichkeit und Leichtigkeit des Zugangs bieten. Jede individuelle Studie im Rahmen dieser Arbeit adressierte die Kupplung von zwei oder mehr molekularen Strukturen zur Erzeugung molekularer definierter Konstrukte. Alle drei vorgestellten Studien enthielten drei wesentliche Zielsetzungen: - das Design eines Strukturgerüst-Liganden Systems; - die Ausarbeitung/Konzeption und Anwendung einer speziellen Synthesestrategie; - die Untersuchung der Bioaktivität, falls erforderlich. Das Ziel der ersten Studie war die Immobilisierung von Proteinen unterschiedlicher Größe und Komplexität auf ein kristallines Nanocellulose Strukturgerüst. Als Liganden wurden drei Biomakromoleküle ausgewählt: ein grün- fluoreszierendes Protein, ein Enzym, Galaktose Oxidase und ein anti-Lysozym Haiantikörper. Die spezifischen Konjugate sollten die Eigenschaften der immobilisierten Proteinen mit den intrinsischen Charakteristika der Cellulose Nanokristalle, wie niedrige Toxizität, Wasser- und Biokompatiblität sowie die, durch ihr nanoskaliges Format bedingten offensichtlichen Vorteile, vereinen. Die zweite Arbeit zielte auf die Entwicklung einer tragfähigen Strategie für die Biofunktionalisierung eines der kleinsten bekannten Nanopartikel, kubisch-oktamerische Silsequioxane (COSS), mit Peptiden. Zunächst sollte eine Vorstudie für die passende Konjugationsplattform mit verschiedenen peptidischen Reaktionspartnern durchgeführt werden. Peptide von unterschiedlicher Länge und Architektur wurden untersucht, darunter eine enzymatische Erkennungssequenz, Cystin-Knoten Miniproteine, ein Integrin bindendes und ein antimikrobielles Peptid, sowie ein Inhibitor einer therapeutischen Protease. Das Design der Synthese, vor allem die Wahl eines geeigneten bioorthogonalen Verfahrens sollte unter der Prämisse erfolgen, dass das COSS-Gerüst in Gegenwart von bestimmten Nukleophilen instabil ist Die dritte Studie war auf die Synthese eines Wirkstofftransportmoduls fokussiert, das aus einem kubisch-oktamerisches Silsesquioxan (COSS) Gerüstmolekül mit zellpenetrierenden Eigenschaften und Doxorubicin, ein cytotoxischen Anthracyclin Antibiotikum, besteht. Dieses komplexe Konstrukt sollte die Zellaufnahme des Wirkstoffes erleichtern und diesen in der Zelle freisetzen. Die Einschränkungen bezüglich der Stabilität des COSS-Gerüstes sollten ebenfalls berücksichtigt werden.Die erste Studie (Angew. Chem. Int. Ed., 2014, 53, 12618-12623) adressierte die Entwicklung eines ortsgerichteten, bioorthogonalen und modularen Syntheseansatzes für die Immobilisierung von Biomolekülen auf einer kristallinen Nanocellulose (CNC) Plattform. Das ultimative Ziel war die kovalente, chemoselektive Immobilisierung von bioaktiven Proteinen auf der Oberfläche von CNC – einer nachhaltigen, natürlichen makromolekularen Verbindung. Die Herausforderung dieser Studie war, die allgemeinen Nachteile der üblicherweise verwendeten Proteinkonjugationsmethoden bezüglich verbesserter Selektivität und Einsatz unter physiologischen Bedingungen in wässrigem Milieu zu vermeiden. Zu diesem Zweck wurde ein generisches Zweistufenverfahren entwickelt, das auf einer Reihe von effizienten orthogonalen Reaktionen basiert, die Notwendigkeit von organischen Lösungsmitteln vermeidet und dadurch kompatibel mit physiologischen Systemen ist. Unter Verwendung von effizienter Oximligation und anschließender Sortase-vermittelter Konjugation zeigte die Synthesestrategie die erforderliche Regiospezifität und Biokompatibilität, die die Anwendung auf eine große Anzahl von funktionellen Proteinen ermöglicht. Durch die TEMPO-vermittelte Oxidation der oberflächenexponierten CNC-Hydroxylgruppen konnte zunächst ein kleiner Fluorophor immobilisiert werden, der die Detektion von Aminooxy-adressierbaren Oberflächenaldehyden ermöglichte. Die anschließende Oximierung mit dem peptidischen Linker wurde validiert und führte zu Sortase A adressierbaren Positionen auf dem CNC-Träger. Anschließend wurde die Enzym-vermittelte Oberflächenimmobilisierung mit drei Proteinen aus unterschiedlichen Klassen, von verschiedener Größe, Komplexität und Bioaktivität unter Erhalt ihrer biologischen Funktion durchgeführt. In dieser Arbeit wurde, aufgrund erhöhter katalytischer Eigenschaften, eine gentechnisch mutierte Variante der Sortase A (eSrtA) verwendet. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die definierte Orientierung durch die ortsselektive Kupplung der Proteinliganden, im Vergleich zu zufällig immobilisierten Proteinen, in einer verbesserten Bioaktivität resultierte. Unter Berücksichtigung dieser Erkenntnisse, kann zusammenfassend gesagt werden, dass diese nachhaltigen, nanoskaligen Biomaterialien eine exzellente Plattform für die spezifische Immobilisierung von anspruchsvollen Makromolekülen für biomedizinische Zwecke, Wirkstofftransport oder –ablagerung darstellen. Die zweite Studie (Chem. Commun., 2015, 51, 11130-11133) widmete sich der Entwicklung einer Synthesestrategie für die Generierung eines hybriden organisch-anorganischen Konstruktes, unter Verwendung eines der kleinsten bekannten kubisch-oktamerischen Nanopartikel (COSS) und eines funktionellen, peptidischen Konjugationspartners. In den Proof-of-Concept Experimenten wurde die Anwendbarkeit des modularen synthetischen Ansatzes, der die Generierung von N-terminalen Peptidaldehyden, effiziente Oximligation und Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (DARinv) kombiniert, anhand der Konjugationen von linearen, Cystin-cyclisierten und multi-Disulfid-verbrückten funktionellen Peptiden demonstriert. Zusätzlich wurde die Strategie auf die Synthese von Konstrukten mit komplexen Strukturen erweitert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Diels-Alder Reaktion mit inversem Elektronenbedarf (DARinv) wegen ihrer Biokompatibilität und schnellen Reaktionskinetik für die Synthese von Biokonjugaten, bestehend aus Peptiden mit unterschiedlicher Länge, molekularer Komplexität und biologischen Eigenschaften, ausgewählt. Zudem hat diese spezielle Reaktion den Vorteil, dass ihr zweiter Schritt aufgrund der Abspaltung von molekularem Stickstoff irreversibel ist und somit das Gleichgewicht auf die Seite der Produktbildung verschiebt. Um die orthogonal adressierbaren Funktionalitäten zu erzeugen, enthielten die synthetisierten Bausteine eine Aminooxy-Einheit jeweilig kombiniert mit einem Tetrazin oder Reppeanhydrid. Diese bifunktionellen Einheiten waren synthetisch leicht zugänglich und wurden in eine Vielzahl von molekularen Konstrukten installiert, ohne deren strukturelle Eigenschaften zu beeinträchtigen. Sukzessive Reaktion über die DARinv resultierte in definierten Konjugaten mit gutem bis quantitativen Umsatz. Die Modularität dieses synthetischen Zweistufenverfahrens bietet den Vorteil, dass sobald die DARinv-Einheit in das Molekül von Interesse installiert wurde, es mit jedem gewünschten Reaktionspartner reagieren kann. Somit ist dieses Verfahren für die Generierung von Peptidkonjugaten, sowohl mit synthetischen als auch rekombinanten Peptiden, anwendbar. Die dritte Studie, die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurde, (Angew. Chem. Int. Ed., 2016, 55, 14842–14846) zielte auf die Ausarbeitung einer synthetischen Strategie für hybride organischanorganische kubisch-oktamerische Silsesquioxan-Derivate und deren Anwendung als Gerüstmolekül für die Generierung eines zellpenetrierenden Transportsystems. In einer vorherigen Studie wurden die zellpenetrierenden Eigenschaften von Ammonium-funktionalisierten COSS-Nanopartikeln und ihre Akkumulation im Nukleoli nachgewiesen. Basierend auf diesen Ergebnissen war der nächste Schritt die Entwicklung von neuen COSS-Partikeln mit positiv geladenen flankierenden Armen und die Untersuchung ihrer zellpenetrierenden Eigenschaften. Der Transport eines therapeutischen Wirkstoffes in lebende Zellen sollte die Funktionsfähigkeit der neuen Generation von molekularen Transportern zeigen. Im Rahmen dieser Studie wurde gezeigt, dass die entwickelten guanidierten COSS-Nanopartikel (GuCOSS) eine viel höhere und schnellere Zellaufnahme zeigten als die üblicherweise verwendeten zellpenetrierenden Peptide (z.B. TAT, Penetratin, Hepta- und Dekaarginine). Diese Effizienz (78-fach höher als bei Heptaarginin, das die gleiche Art und Anzahl von geladenen Gruppen trägt) kann durch die geringe Größe und die dadurch bedingte hohe Ladungsdichte um den COSS-Kern erklärt werden. Interessanterweise zeigten sich unsere neuartigen, zellgängigen Module promiskuitiv hinsichtlich der Zielzellen. Tatsächlich wurde eine effiziente zelluläre Aufnahme in verschiedene Zellarten beobachtet, darunter Gram-negative Bakterien (Escherichia coli), Hefe (Saccharomyces cerevisiae) und Archeen (Sulfolobus islandicus, Sulfolobus tokodaii, Halobacterium salinarum) sowie humane Krebszelllinien. Da die Zellaufnahme bei 4°C im Vergleich zu der bei 37°C nur unwesentlich reduziert war, wurde ein energieunabhängiger Mechanismus vorgeschlagen. Zusätzlich degradiert der COSS-Kern innerhalb der Zelle und für die Einzelkomponenten an sich wurde keine bis niedrige Toxizität vorhergesagt. Diese Erwartung wurde durch die Untersuchung der Zellaufnahme, Toxizität und Degradation des GuCOSSModuls bestätigt. Als Proof-of-Concept Cargo für den intrazellulären Transport wurde der therapeutische Wirkstoff Doxorubicin verwendet, da dieser in freier Form nur sehr langsam durch passive Diffusion in die Zelle permeieren kann. Doxorubicin wurde über eine Disulfidbrücke an den hocheffizient-zellpenetrierenden heptaguanidierten COSS-Nanopartikel konjugiert. Das jeweilige Oktaammonium COSS-Derivat wurde dafür an einer Ecke mit einem Cystein, funktionalisiert. Anschließende Guanidinylierung der verbleibenden Amine, gefolgt von der Bildung einer Disulfidbindung über das Aldrithiol™-2- modifizierte Zytotoxin resultierte in einem hybriden zellpenetrierenden Konjugat an das ein Wirkstoff eine Disulfidbrücke angebunden ist. Die Disulfidbrücke sollte in dem reduzierenden Milieu des Zytoplasmas gespalten werden und das Zytotoxin freigeben. Die durchgeführten Zytotoxizitätsstudien der Hybride zeigten eine erhöhte Toxizität gegenüber dem freien Wirkstoff. Zusätzlich konnte die Inkubationszeit durch die schnelle Zellaufnahme signifikant reduziert werden. Da es viele Wirkstoffe gibt, die nicht zellgängig sind und/oder schlecht wasserlöslich, z.B. Hygromycin, Ispinesib etc. eröffnet der GuCOSS-basierte molekulare Transporter neue Wege für die erleichterte Aufnahme dieser Therapeutika. Zusammengenommen leisten die Ergebnisse dieser kumulativen Forschungsarbeit, im Hinblick auf die Anwendbarkeit, Vielseitigkeit, Zuverlässigkeit und Kompatibilität mit komplexen molekularen Strukturen, unabhängig ihres Ursprungs, einen Beitrag zur Toolbox der modernen, bioorthogonalen Methoden. Darüber hinaus erweitert die Kombination von klassischer Chemie mit modernen, biokompatiblen Ligationsmethoden, darunter beispielsweise Enzym-unterstützte Reaktionen, das Spektrum bioorthogonaler Konjugationsstrategien.

Frage zum Eintrag

Redaktionelle Details anzeigen