Rudolph, Michael Martin (2016)
Entwicklung und Anwendung synthetischer RNA-Schalter zur Regulation der Genexpression.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Der genetische Werkzeugkasten des relativ jungen Forschungsgebietes der Synthetischen Biologie wird ständig durch neue Bauteile erweitert, wobei in den letzten Jahren verstärkt die Anwendung RNA-basierter Regulationselemente in den Fokus gerückt ist. In dieser Arbeit wird die Entwicklung und Anwendbarkeit dieser sogenannten synthetischen Riboswitche zur konditionalen Genexpression für verschiedene Organismen beschrieben. Im ersten Teil wird die in vitro-Selektion (SELEX) von RNA-Aptameren gezeigt, die als sensorische Domänen zum Aufbau dieser Riboswitche genutzt werden können. Als Zielsubstanzen dienten dabei Azobenzole. Das sind photochrome Moleküle, die eine reversible Konformationsänderung durch Licht unterschiedlicher Wellenlängenbereiche erfahren. Die Selektionen hatten dabei das Ziel der Anreicherung photoschaltbarer Aptamer-Liganden-komplexe, wobei die jeweiligen trans-Isomere bevorzugt werden sollten. Zunächst wurde eine in vitro-Selektion gegen das Azobenzol TH72 unter Verwendung paramagnetischer streptavidinbeschichteter Partikel durchgeführt. Hier wurde eine Anreicherung bindender RNA-Spezies erzielt, welche jedoch nicht imstande waren, das freie Zielmolekül zu erkennen, sondern eine Abhängigkeit zur Selektionsmatrix aufwiesen. Durch eine SELEX mittels säulenbasierter Affinitätschromatographie gegen die mit einer Chloramphenicoleinheit substituierten Azobenzole TH-CA bzw. TH-CA-Amino wurden indes Aptamere identifiziert, welche freie Zielmoleküle binden konnten und sich durch Dissoziationskonstanten im niedrigen mikromolaren Bereich auszeichneten (Kd = 0,8 – 3,6 µM). Für die Aptamere 42 und 42_V1 wurden darüber hinaus lichtabhängige Bindeverhalten gezeigt, wobei die cis-Isomere der Azobenzole nicht oder nur sehr schwach gebunden wurden. Ein erster Konstruktionsversuch azobenzolabhängiger Riboswitche im Hefetestsystem war noch nicht zielführend. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einsatz synthetischer theophyllinabhängiger Riboswitche zur konditionalen Genexpression in Streptomyces coelicolor geprüft. Die von Justin P. Gallivan entwickelten RNA-Schalter ließen sich mit allen drei getesteten Promotoren galP2, ermEp1 und SF14 kombinieren. Hierdurch konnten insbesondere die Riboswitche A und E* als robuste Schaltelemente identifiziert werden, welche eine 30- bis 260-fache Aktivierung der ß-Glucuronidaseexpression zuließen. Mit Riboswitch E* ließ sich darüber hinaus zeigen, dass die Genexpression dosisabhängig und zu bestimmten Zeitpunkten der Kultivierung kontrolliert werden konnte. Das Riboswitchsystem zeichnete sich somit als leicht zu implementierende, modular kombinierbare und zudem robuste Methode zur konditionalen Genexpression aus und könnte auch für diverse native und heterologe Proteine in anderen Streptomyces-Arten zur Anwendung kommen.

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