Kapitel I: Die Reifung mitochondrialer Transkripte in Afrikanischen Trypanosomen erfordert eine RNA-Editierungsreaktion, die durch das Einfügen und Löschen von U-Nukleotiden in ansonsten nichtfunktionale mRNAs gekennzeichnet ist. Die Reaktion wird durch das Editosom katalysiert und erfordert guide(g)RNAs als Matrizen. Neuere Daten zeigen, dass auf die Bindung von pre-mRNAs an Editosome eine chaperonartige RNA-Restrukturierungsreaktion folgt. Hier verfolgen wir diese Strukturänderungen der RNAs durch selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). Wir zeigen, dass die pre-mRNAs in ihrem freien Zustand komplex gefaltete, hochstabile 2D-Strukturen einnehmen. Die Bindung der RNAs an das Editosom führt zu RNA-2D-Strukturen mit reduzierter Stabilität. Im Durchschnitt sind 30% der Nukleotide einer jeden RNA, mit einer Prävalenz für U-Nukleotide, betroffen. Die Daten zeigen, dass die Chaperoneaktivität die Flexibilität von U-Nukleotiden erhöht was zur einer Abnahme deren Basenpaarungswahrscheinlichkeiten führt. Dies resultiert in einer vereinfachten RNA-Faltungslandschaft und einer reduzierten Energiebarriere, was die Bindung von gRNAs erleichtert. Diese Daten liefern eine Erklärung für die enigmatische U-Spezifität der RNA-Editierungsreaktion.

Kapitel II: Die Reifung mitochondrialer Transkripte in Afrikanischen Trypanosomen erfordert eine RNA-Editierungsreaktion. In der extremsten Form werden hunderte Us zur Generierung funktionaler mRNAs in die Primärtranskripte eingefügt oder gelöscht. Sowohl der evolutionäre Ursprung als auch die biologische Notwendigkeit blieben rätselhaft. Hier beschreiben wir ein bisher unbemerktes strukturelles Merkmal der pre-editierten mRNAs, welches auf einen definierten evolutionären Ursprung hindeutet. Wir zeigen, dass die kryptischen pre-mRNAs zahlreiche, aufeinanderfolgende G-Nukleotide beherbergen, welche zu G-Quadruplexen (GQ) falten. Wir identifizierten 27 GQs in verschiedenen pre-mRNAs und zeigen eine positive Korrelation zwischen der gRNA-Abundanz im steady state und der Sequenzposition der GQ-Elemente. Wir postulieren, dass sich hinter der Selektion auf G-reiche Sequenzen die Formierung von DNA/RNA-hybrid-G-Quadruplexen (HQ) zwischen den pre-editierten mRNAs und den non-template strands des mitochondrialen Genoms als treibende Kraft verbirgt. HQs sind Transkriptionsstopp- und Replikationsinitiationsstellen und garantieren eine fehlerfreie Replikation des mitochondrialen Genoms. Dies ist essentiell für den Erhalt des Lebenszyklus des Parasiten. Im „Transkription-An“ Stadium ist die RNA-Editierungsreaktion als GQ-auflösender Mechanismus nötig, was darauf hinweist, dass die beiden Prozesse koevolviert sind und identifizieren den Zell- und Lebenszyklus des Parasiten als treibende evolutionäre Kräfte.

Kapitel III: Die Reifung mitochondrialer Transkripte in Afrikanischen Trypanosomen erfordert eine RNA-Editierungsreaktion durch welche nichtfunktionale pre-mRNAs zu translatierbaren mRNAs prozessiert werden. Die Reaktion ist gekennzeichnet durch das sequenzortsspezifische Einfügen oder Löschen von ausschließlich U-Nukleotiden. Manche Transkripte reifen durch das Einfügen von hunderten Us, was die kryptische Natur der verschiedenen pre-mRNAs verdeutlicht. Neben dem Fehlen von proteincodierender Information sind diese RNAs durch einen ungewöhnlich hohen G-Gehalt gekennzeichnet, was in der Mehrheit zur Ausprägung hoch stabiler 2D-Strukturen führt, welche teils sogar G-Quadruplex- (GQ)-Strukturelemente beherbergen. Aufgrund extremer „Crowding“-Bedingungen in den Mitochondrien Afrikanischer Trypanosomen ist unklar, ob diese Strukturen den in vivo Zustand widerspiegeln. Hier analysieren wir die Effekte von „Crowding“-Bedingungen auf die Struktur der mitochondrialen RPS12-pre-mRNA. Wir nutzen Polyethylenglykol (PEG4000) als neutrales, makromolekulares Kosolut zur Imitation der Lösemittelbedingungen innerhalb des Mitochondriums und wir bestimmen die Struktur der RNA auf globaler Ebene mit nukleotidgenauer Auflösung. Wir zeigen, dass durch Makromoleküle vermittelte „Crowding“-Bedingungen keinen Einfluss auf die 2D-Struktur der RPS12-pre-mRNA hat und folgern, dass die ermittelten Strukturen der minimalen Gibbs'schen freien Energie (MFE) in verdünnter Lösung eine gute Annäherung an die Strukturen im Kontext des mitochondrialen Systems darstellen.

Kapitel IV: Afrikanische Trypanosomen sind protozoische Parasiten und Erreger der Schlafkrankheit. Die Reifung mitochondrialer Transkripte in diesen Organismen benötigt eine RNA-Editierungsreaktion, welche durch das Einfügen und Löschen von U-Nukleotiden in ansonsten nichtfunktionale mRNAs gekennzeichnet ist. Die RNA-Editierungsreaktion ist ein ideales Ziel für die parasitenspezifische, therapeutische Intervention, da diese Reaktion im Wirt nicht vorkommt. Außerdem ist für die RNA-Editierungsreaktion ein makromolekularer Proteinkomplex notwendig, welcher nur im Parasiten existiert: Das Editosom. Aus diesem Grund begrenzte sich die Suche nach Inhibitoren der RNA-Editierungsreaktion auf Moleküle, welche an die Proteine des Editosoms binden. In Analogie zu anderen RNA-getriebenen Prozessen sollte es jedoch möglich sein, die RNA-Editierungsreaktion durch RNA-bindende Liganden zu stören. Hier beschreiben wir die Inhibition der RNA-Editierungsreaktion durch spezifische Aminoglykoside. Die Moleküle binden in die große Furche der gRNA/pre-mRNA-Editierungssubstrate, was zu einer Stabilisierung der RNA-Moleküle durch Ladungskompensation und einer Verstärkung der Basenstapelung führt. Die Daten geben Einblicke in die mechanistischen Details der RNA-Editierungsreaktion und identifizieren die kritischen Parameter für die Entwicklung trypanozider Wirkstoffe.