Cavlovic, Lidija (2015)
Wirkung von ionisierender Strahlung auf Proteom und Lipidom sowie auf zelluläre und mitochondriale Aktivität.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Wirkung von ionisierender Strahlung auf die nukleare DNA (nDNA) und die daraus resultierenden Schäden und ihre Reparatur sind, verglichen zu der Wirkung auf die mitochondriale DNA (mtDNA), zellulären Proteine oder auch Lipide und die sich daraus ergebende zelluläre Antwort, umfassender erforscht und verstanden (Leach et al., 2001). Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die in vitro Untersuchung von zellulärer Strahlungsantwort, insbesondere der von Mitochondrien. Als experimentelles Modellsystem dienten immortalisierte Oligodendrozyten aus Rattenhirn, OLN-93. Dabei wurde die Wirkung von ionisierender Strahlung in den ersten 14 Tagen nach Bestrahlung der Zellen mit Röntgenstrahlung mit einer Dosis von 8 Gy analysiert. Alle analysierten strahlungsinduzierten Wirkungen wurden stets in einen Vergleich zu entsprechenden unbestrahlten Proben gestellt und diskutiert. Die Untersuchungen umfassten zum einen die Analysen von mitochondrialem Proteom und Lipidom und zum anderen Analysen der physiologischen Merkmale der Zellen, die bekanntlich u.a. mitochondrial gesteuert werden. Die Proteomanalyse erfolgte an nativ isolierten Mitochondrien. Bei der angewandten „crude“ Isolierungsmethode wurde als Priorität die Aufrechterhaltung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften der Mitochondrien und ihren Proteinen gelegt. Somit traten bei nachfolgenden Analysen des mitochondrialen Proteoms als Kontamination ebenfalls nicht mitochondriale Proteine auf. Die Proteomanalyse umfasste: a) Massenspektrometrische Identifizierung von, mittels 2D-BN/SDS Elektrophorese aufgetrennten, Proteinen, b) Die densitometrische Auswertung von Proteinspots auf 2D-BN/SDS Gelen und die Analyse der relativen Proteinmenge in Abhängigkeit von der Bestrahlung (Röntgenstrahlung, 8 Gy) der Zellen und c) Analyse der Aktivität von Komplex I und IV in ihrer individuellen und superkomplexen Form mittels In-Gel Aktivitätstests. Die mittels massenspektrometrischer Peptide Mass Fingerprinting (PMF) Methode durchgeführte Identifizierung von Proteinen aus mitochondrialen Proben von OLN-93 Zellen in 2D-BN/SDS Gel lieferte, im Anbetracht der allgemein gültigen Schwierigkeiten die bei den Zellkulturproben auftreten (im Vergleich zu Gewebeproben bei gleicher Proteinmenge ist die Anzahl der Proteinspots deutlich kleiner und diese sind wesentlich schwächer sichtbar nach jeglichen Färbeverfahren), ausgesprochen zufriedenstellende Resultate. Insgesamt 98 Proteine wurden aus dem Gel extrahiert und analysiert. Erfolgreich war die Identifizierung von 63 Proteinspots, darunter erwiesen sich 27, laut der Datenbank, als mitochondriale Proteine. Die quantitative Analyse der Proteinmenge wurde für einige OxPhos- und Hitzeschockproteine (HSP) durchgeführt. Die densitometrische Auswertung der SYPRO-Ruby gefärbten Proteinspots auf 2D-BN/SDS Gelen erfolgte mittels Delta2D Software. Dabei konnte gezeigt werden, dass die ionisierende Strahlung einen reduzierenden Einfluss auf die Menge der Komplexe und Superkomplexe der oxidativen Phosphorylierung hat. Im Falle von HSPs zeigte sich strahlungsabhängig die Zunahme der Menge für das HSP60 und HSP90β Protein, während die Menge vom Hyou1 (Mitglied der HSP70 Proteinfamilie) unbeeinflusst blieb. Die aufgetretenen Änderungen waren stets ausgeprägter zu den analysierten Zeiten, die näher an dem Zeitpunkt der Bestrahlung lagen (Tag 1 und 4 nach der Bestrahlung). Weiterhin wurde die Wirkung von ionisierender Strahlung auf das mitochondriale Proteom bei den Untersuchungen der enzymatischen Aktivität der Komplexe I und IV beobachtet. Dabei zeigte sich eine Abnahme der relativen Enzymaktivität für den individuellen Komplex I, sowie für den Komplex I in den Superkomplexen. Die Abnahmen waren dabei für den individuellen Komplex stärker ausgeprägt. Die relative enzymatische Aktivität vom Komplex IV war dagegen strahlungsabhängig erhöht. Die Erhöhung der relativen enzymatischen Aktivität war für Komplex IV in Superkomplexen größer als für den individuellen Komplex. Die Untersuchung der Wirkung von ionisierender Strahlung auf das mitochondriale Lipidom erfolgte durch: a) Analyse der Membranfluidität mittels Fluoreszenz-Anisotropie der in der Membran befindlichen Fluoreszenzsonden und b) MALDI-TOF MS Analyse der Membran-Lipidzusammensetzung an intakten Mitochondrien. Es zeigte sich bei der Analyse der „Fluidität“ der mitochondrialen Membranen statistisch signifikante Wirkung von ionisierender Strahlung. Dabei blieb diese strahlungsinduzierte Änderung für die gesamte Zeitspanne von 14 Tagen nach der Bestrahlung bestehen. Die Anisotropie-Werte der bestrahlten Proben waren durchschnittlich um 0,02 niedriger als die von unbestrahlten Proben, was eine strahlungsinduzierte Erhöhung der Membranfluidität widerspiegelt. Diese Änderungen konnten als ein für die Mitochondrien spezifischen Effekt der ionisierenden Strahlung beobachtet werden, denn die Analysen der Fluidität der Zellmembran ergaben keine strahlungsabhängige Unterschiede. Die ionisierende Strahlung scheint keinen Einfluss auf die Lipidzusammensetzung der mitochondrialen Membranen zu haben. Dies konnte während der Zusammenarbeit mit Frau Stefanie Kern (Kern, 2013b) und Herrn Michael Muschol (Muschol, 2014) im Rahmen der Etablierung der innovativen massenspektrometrischen Methode zur Analyse der Lipidzusammensetzung an intakten Mitochondrien gezeigt werden. Um die zellulären und mitochondrialen Aktivitäten zu untersuchen, erfolgte eine Reihe von Experimenten, die alle entweder durchgehend über die analysierte Zeitspanne, oder nur zu bestimmten Zeitpunkten strahlungsinduzierte Änderungen zeigten. So konnte eine mit der Zeit nach der Bestrahlung kleiner werdende Zunahme in der ATP Menge in bestrahlten Zellen beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde in zwei unabhängigen Experimenten beobachtet. Eine dritte Wiederholung ergab allerdings nur eine Zunahme der ATP Menge für den Tag 1 nach der Bestrahlung, während bei späteren Zeiten die ATP Menge strahlungsabhängig unbeeinflusst blieb. Weiterhin wurden eine Zunahme der ROS Menge und eine Hyperpolarisation des mitochondrialen Membranpotentials am Tag 1 nach der Bestrahlung beobachtet, aber auch zu anderen Zeiten nach der Bestrahlung zeigten sich strahlungsinduzierte Änderungen. Die ionisierende Strahlung wirkte sich außerdem auf das Wachstum der Zellpopulation, sowie auf zelluläre metabolische und endozytosolische Aktivitäten aus. Einen umstrittenen Parameter bei den Strahlungsstudien in konventionell in vitro kultivierten Zellen stellt der Sauerstoffgehalt dar. Um die Bedeutung von Sauerstoffgehalt auf die Strahlungsantwort der Zellen in solchen Studien zu erforschen, werden oft u.a. chemische Hypoxie-Nachahmer eingesetzt. In Rahmen dieser Arbeit wurden Experimente ebenfalls unter Einsatz von dem in der Literatur bekannten chemischen Hypoxie-Nachahmer CoCl2 durchgeführt. Dabei wurde die Wirkung von ionisierender Strahlung abhängig von der Zugabe von 300 µM CoCl2 zum Nährmedium analysiert. Weiterhin wurden die gefundenen Effekte des CoCl2 auf die Strahlungsantwort kritisch in Vergleich gezogen mit den aus der Literatur bekannten Effekten der realen Hypoxie (tatsächlich verminderter Sauerstoffgehalt). Die Ergebnisse zeigten, dass CoCl2 einen mildernden bzw. umkehrenden Effekt auf die Strahlungsantwort der Zellen hat. Bei der Analyse der mitochondrialen Membranfluidität wurde festgestellt, dass die strahlungsinduzierte Erhöhung in CoCl2 behandelten Zellen nicht auftrat. Weiterhin konnte die beobachtete strahlungsinduzierte Erhöhung der ROS Menge, wie auch von dem mitochondrialen elektrochemischen Potential in Gegenwart von CoCl2 nicht detektiert werden. CoCl2 hatte einen Effekt auf die Lipidzusammensetzung der mitochondrialen Membranen, unabhängig von der Aussetzung der Zellen ionisierender Strahlung. Im Vergleich zu vielen früheren Studien zur Analyse der Wirkung der realen Hypoxie auf die Strahlenresistenz kann gesagt werden, dass der mildernde und umkehrende Einfluss von CoCl2 mit diesen teilweise in Einklang steht. Auf molekularer Ebene bewirkt CoCl2 die Inhibierung von Prolyl-Hydroxylasen (PHDs) mit der Folge der Stabilisierung des HIF-1 Transkriptionsfaktors, welcher wiederum zur Aktivierung zahlreicher Gene führt und somit u.a. Strahlenresistenz bewirken kann. Die reale Hypoxie führt zur Stabilisierung von HIF-1 Transkriptionsfaktor, außer durch die Inaktivierung von PHDs, noch über mehrere Ebenen und erhöht dazu seine Translation und Transaktivierungsaktivität. Aus diesen Gründen und aufgrund zum Teil unbekannten Hypoxie-unähnlichen Einflüssen von CoCl2 auf die Zellen kann zusammenfassend die Benutzung von CoCl2 als Hypoxie-Nachahmer als ungeeignet angesehen werden.

Kernaussagen dieser Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: Die ionisierende Strahlung (Röntgenstrahlung, 8 Gy) beeinflusst viele der in dieser Arbeit untersuchten Parameter. Die Mitochondrien stellen ein sehr wichtiges Target für die ionisierende Strahlung dar und in Anbetracht ihrer vielseitigen Einflüsse und Involvierung in die Steuerung der zellulären Prozesse (Apoptose, ATP Produktion, usw.), beeinflussen diese die gesamte zelluläre Antwort auf die Strahlung, aber auch auf andere Stressfaktoren. Die konventionelle in vitro Kultivierung von Zellen ist, insbesondere aufgrund des erhöhten Sauerstoffgehalts, kritisch zu betrachten. Die Untersuchungen der zellulären Antwort auf die low-LET Strahlung, zu der auch Röntgenstrahlungen zählen, sollen unter möglichst physiologischen Sauerstoffbedingungen durchgeführt werden, da diese zum größten Teil die Zellen durch indirekte Wirkung schädigen. Diese Schäden sind häufig, abhängig von dem zellulären Sauerstoffgehalt, für die Zellen apoptotisch (irreparabel) oder reparabel.

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