Obwohl wir permanent von einer Vielzahl von Pathogenen umgeben sind, werden wir nur selten krank. Dieses Phänomen ist auf die Gegenwart des Immunsystems zurückzuführen, das den Körper vor eindringenden Mikroorganismen schützt. Eine zentrale Rolle in der Induktion und Koordination adaptiver Immunantworten wird antigen-präsentierenden Zellen (engl. antigen presenting cells, APCs), wie dendritischen Zellen (engl. dendritic cells, DCs), und CD4+ T Lymphozyten zugeschrieben. Aufgrund ihrer bedeutenden Funktion sind diese Zelltypen in den Fokus der Immuntherapie gerückt. Ihre spezifische Modifikation ist dabei für verschiedene Anwendungen erstrebenswert, unter anderem für prophylaktische und therapeutische Impfung und die Bekämpfung von Infektionen durch das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1). In den vergangenen Jahren haben sich besonders virale Vektoren als nützliche Hilfsmittel für die genetische Modifikation von Zielzellen erwiesen. Unter ihnen sind vor allem lentivirale Vektoren (LVs) von großem Interesse, da sie nicht nur mitotisch aktive, sondern auch ruhende Zellen transduzieren können. Durch Pseudotypisierung mit den modifizierten Masernvirus (MV) Glykoproteinen (GPs) Hämagglutinin (H) und Fusionsprotein (F) kann ihnen Spezifität für nahezu jeden beliebigen Rezeptor verliehen werden. Zudem können retrovirale und lentivirale Vektoren neben dem Transfer von Genen auch heterologe Proteine in ihre Zielzellen übertragen, insofern diese genetisch mit Strukturproteinen der Vektorpartikel fusioniert wurden („Proteintransfervektoren“, PTVs). Basierend auf diesem System war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, lentivirale Vektoren für die zielgerichtete Modifikation von SLAM+ (Akronym für engl. signaling lymphocyte activation molecule) APCs und CD4+ T Lymphozyten zu generieren.

Initial wurde die Herstellung von PTVs optimiert, um maximalen Gen- und Proteintransfer in transduzierte Zellen zu ermöglichen. Um zudem zielgerichtet SLAM+ Zellen modifizieren zu können, wurden PTVs mit zytoplamatisch verkürzten MVwt-GPs pseudotypisiert, die bekanntermaßen einen Tropismus für SLAM aufweisen. Neben SLAM war die Existenz eines bis dato unbekannten epithelialen MV-Rezeptors postuliert worden, zu dessen Identifikation als Adhärenzverbindungsprotein Nectin-4 die vorliegende Arbeit beigetragen hat, um SLAM- Zielzellpopulationen von MVwt-GPs zu charakterisieren. Tatsächlich waren Markergen- und GFP-, Cre- oder Ovalbumin- (Ova) Cargoproteintransfer komplett auf SLAM- und Nectin-4-positive CHO-Zellen und natürlich SLAM-exprimierende B Zelllinien beschränkt, während VSV-G pseudotypisierte Kontrollvektoren einen breiten Tropismus aufwiesen. Das spezifische Ausschneiden einer loxP-flankierten cerulean-Expressions¬kassette in transduzierten, rezeptorpositiven Indikatorzelllinien, das durch die in PTVs verpackte Rekombinase Cre katalysiert wurde, demonstrierte beispielhaft sowohl den zytoplasmatischen Transfer als auch die unbeeinträchtigte Funktion des übertragenen Cargoproteins. Schlussendlich konnte gezeigt werden, dass der PTV-vermittelte Transfer des Modellantigens Ova in rezeptorpositive APCs in vitro und in für humanes SLAM transgene Mäuse oder Kontrollmäuse in vivo zur Stimulation antigen-spezifischer T Lymphozyten, und hier vor allem CD8+ T Lymphozyten, führt.

Im Gegensatz zu SLAM-spezifischen PTVs, deren Tropismus auf MVwt-GPs basierte, wurde die Spezifität eines gezielt CD4+ Zellen transduzierenden LVs (CD4-LV) durch Pseudotypisierung mit modifizierten MV-GPs erreicht, wobei ein CD4-spezifisches DARPin (Akronym für engl. designed ankyrin repeat protein, konzipierte Proteine mit Ankyrinwiederholungseinheiten) als Bindedomäne an rezeptorblindes H fusioniert wurde. Die gute Oberflächenexpression von H-αCD4 in HEK-293T Verpackungszellen ermöglichte den effizienten Einbau in CD4-LV-Partikel und war Grundlage für die mit durchschnittlich > 10e8 transduzierenden Einheiten/ ml hochtitrigen Vektorstocks nach Aufkonzentration. In vitro zeigte CD4-LV absolute Spezifität für CD4+ Zelllinien und CD4+ T Lymphozyten in der natürlich gemischten Zellpopulation primärer PBMC (Akronym für engl. peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes), während keine Transgenexpression in CD4- Zellen detektiert werden konnte. Dabei ist besonders hervorzuheben, dass CD4-LV nicht nur in der Lage war, aktivierte sondern auch ruhende, primäre CD4+ Lymphozyten stabil zu transduzieren. Zudem konnten auch CD4+ Makrophagen in vitro mit dem Vektor transduziert werden. Nach systemischer Applikation von gfp/luciferase übertragendem CD4-LV wurde Luziferaseaktivität vor allem in den lymphatischen Organen von mit humanen PBMC oder hämatopoetischen Stammzellen repopulierten NOD-scid IL2Rγ-/- Mäusen detektiert. Durchflusszytometrische Analysen der GFP-Expression in lymphatischen Organen und Blut bestätigten die bereits in vitro beobachtete strikte Rezeptorabhängigkeit der Transduktion auch in vivo. Interessanterweise konnte eine bevorzugte Transduktion von CD4+ T-Gedächtniszellen gegenüber naiven CD4+ T Lymphozyten beobachtet werden.

Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit die Eignung von mit (modifizierten) MV-GPs pseudotypisierten LVs für den selektiven Protein- und Gentransfer in verschiedene Immunzellsubtypen gezeigt werden. Durch die erfolgreiche Herstellung SLAM- beziehungsweise CD4-spezifischer LVs, die die gezielte Modifikation von SLAM+ APCs oder CD4+ T Lymphozyten, einschließlich ruhender T Lymphozyten, erlaubten, wurde die breite Anwendbarkeit des auf MV-GPs basierenden Zelleintrittstargetings für verschiedene Zelloberflächenrezeptoren unterstrichen. Sowohl PTVs als auch CD4-LV stellen vielversprechende Hilfsmittel für Grundlagenforschung und Gen- und Immuntherapie dar und eröffnen damit neue Möglichkeiten für eine Vielzahl verschiedenster Anwendungen.