Gilbert, Bianca (2015)
Charakterisierung der humanen 5 Lipoxygenase als direktes Targetgen des Tumorsuppressors p53 und seine Relevanz für die Tumorgenese.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Bei dem Tumorsuppressor p53 handelt es sich um einen Transkriptionsfaktor, der eine Schlüsselrolle bei der Regulierung von zellulären Schadenssignalwegen einnimmt. Oxidativer Stress, Entzug von Wachstumsfaktoren, Hitzeschock, Hypoxie, DNA-Schäden oder fehlerhafte Zellteilung führen zu einer Aktivierung und Akkumulierung von p53. Dadurch werden Prozesse aktiviert, die Zellzyklusarrest, DNA-Reparatur, Autophagie, Seneszenz oder Apoptose induzieren können. Aufgrund der Funktion zur Aufrechterhaltung des Gleichgewichtes zwischen Zellproliferation und Zelltod wird p53 auch als Wächter des Genoms bezeichnet. Angeborene oder spontan auftretende Mutationen des Gens TP53 haben verheerende Auswirkungen auf die Genregulation. Zu den häufigsten genetischen Aberrationen gehören Punktmutationen, die zu einer fehlerhaften Expression des Proteins führen. Bereits in vorangegangenen Studien konnte gezeigt werden, dass mehr als 55% aller Krebszellen eine Veränderung in einem der beiden Allele des TP53-Gens aufweisen. Dies kann zum einen zu einem vollständigen Funktionsverlust des Transkriptionsfaktors führen („loss of function - LOF“) und zum anderen einen Funktionszugewinn („gain of function - GOF“) des p53-Proteins bedeuten. Dabei führen GOF-Mutationen zu veränderten p53-Proteinen mit neuen onkogenen Eigenschaften. Der Defekt bzw. die Dysregulation der Signalwege ist durch den Verlust der Zellzykluskontrolle sowie der Induktion des programmierten Zelltodes charakterisiert. Dadurch sind die Zellen einer unkontrollierten Proliferation ausgesetzt und deren Tumorgenese wird gesteigert. Chronische Entzündungen sowie Infektionen zählen ebenso zu den möglichen Vorstufen von Tumoren. Erhöhte Expression pro-inflammatorischer Gene sowie die Sezernierung hochwirksamer Lipidmediatoren spielen dabei eine entscheidende Rolle. Infolge von intrazellulären sowie extrazellulären Stresseinwirkungen erfolgt eine Aktivierung und Akkumulierung von p53 im Nukleus, wo er als sequenzspezifischer Transkriptionsfaktor an hochkonservierte Konsensussequenzen der Targetgene bindet und diese reguliert. Auf transkriptioneller Ebene ist p53 in der Lage als Aktivator oder als Repressor zu fungieren. In den durchgeführten Experimenten wurden als p53-Aktivatoren die klassischen Zytostatika Actinomycin D (Act.D) und Etoposid (Eto) eingesetzt. Die Behandlung mit Act.D führte selektiv in wtp53-exprimierenden Zellen zu einem G1-Arrest, wohingegen Eto einen G2-Arrest induzierte. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals durch eine Chromatin-Immunopräzipitation mit anschließender Sequenzierung, die direkte Bindung von p53 an das Targetgen ALOX5 beschrieben werden. ALOX5 kodiert für die humane 5-Lipoxygenase, welches ein wichtiges Schüsselenzym der Leukotrien-Biosynthese darstellt. Das Enzym katalysiert, mit Hilfe von FLAP, eine zweistufige Redoxreaktion der Arachidonsäure (AA) zu LTA4. Aus dem Vorläufermolekül LTA4 erfolgt wiederum die Umsetzung zu den pro inflammatorischen Leukotrienen. Das ALOX5-Gen befindet sich auf Chromosom 10q11.21 und besteht aus 14 Exons separiert durch 13 Introns. Die charakterisierte Bindungsregion von p53 befindet sich nicht im Promotorbereich sondern downstream, in der nicht-kodierenden Intron G Sequenz (Intron 7). Innerhalb dieser Sequenz konnte ein vorständig konserviertes p53-Bindemotiv identifiziert werden. Diese besteht aus vier Kopien einer palindromischen Sequenz 5´-RRRCWWGYYY-3´. Durch ChIP Experimente konnte die Bindung des Transkriptionsfaktors bestätigt werden. Mittels Reportergen Analyse konnte gezeigt werden, dass es sich bei dem Bindungsmotiv um einen Enhancer-Bereich handelt, der die transkriptionelle Expression des Gens verstärkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass p53 ein wichtiger Transkriptionsfaktor bei der Regulierung der 5-LO ist. In weiterführenden Experimenten wurde die 5-LO-Expression in Abhängigkeit vom p53 Wildtyp Status analysiert. Dazu wurden verschiedene p53 exprimierende Zelllinien untersucht (wtp53, mutp53 und p53-null Zelllinien). Die Daten ergaben, dass 5-LO ausschließlich in Zellen mit wtp53-Status exprimiert wurde. Zelllinien mit einer p53 Mutation und dem damit verbundenem Verlust der DNA-Bindung (LOF), zeigten keine transkriptionelle Regulation der 5-LO. Der endgültige Beweis einer p53 vermittelten, transkriptionellen Regulierung erfolgte anhand von Knockdown Studien. In diesen Zellen wurde p53 gezielt durch shRNA herunterreguliert. Wiesen die Zellen zuvor eine deutliche und signifikante Induktion der 5-LO auf, konnte nach dem p53 Knockdown nur noch eine verminderte Expression nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde mittels Immunfluoreszenzanalysen die Lokalisation von p53 und 5 LO untersucht. Dabei konnte in Act.D bzw. Eto stimulierten U2OS-Zellen beobachtet werden, dass 5 LO und p53 zeitgleich im Nukleus lokalisieren. Aufnahmen von optischen Serienschnitten der überlagerten Bereiche, bestätigten eine signifikante Kongruenz nach beiden Behandlungen. Aufgrund der beobachteten Kolokalisation, wurden infolgedessen Interaktionsstudien der Proteine durchgeführt. Diese Experimente zeigten, dass sowohl rekombinante als auch überexprimierte 5-LO an den Tumorsuppressor p53 binden können. Nachfolgende Reportergen-Analysen zeigten einen deutlichen Effekt der 5-LO auf die p53-vermittelte Expression. Dabei induzierte überexprimierte 5-LO eine deutlich verminderte Promotoraktivität des p53 regulierten, pro-apoptotischen Targetgens BAX. Zusätzlich konnte eine Expressionsänderung von denp53-regulierten Targetgenen CDKN1A (Cyclin-dependent-Kinase-Inhibitor 1A (p21)), DDB2 (Damaged-DNA-binding-Protein 2), PCNA (Proliferating-Cell-Nuclear-Antigen) und PTEN (Phosphatase and Tensin homolog) in 5 LO-überexprimierenden U2OS-Zellen beobachtet werden. Phänotypische und genotypische Charakterisierungen von 5 LO Knockdown-Zellen (U2OS und HCT116) zeigten, neben einersignifikanten Abnahme der ALOX5-Transkripte, zusätzlich eine drastische Abnahme der TP53 Expression. Da für überexprimierte 5-LO erhöhte proliferierende- und anti-apoptotische Eigenschaften beobachtet werden konnten, wurde die Apoptoserate in den 5-LO-Knockdown Zellen überprüft. Dabei konnte gezeigt werden, dass der Anteil der früh-apoptotischen Zellen bei den untersuchten Zelllinien HCT116p53+/+ und HCT116p53-/- nach dem 5-LO-Knockdown höher als bei den Kontrollzellen (5-LO-WT) war. Zusätzlich konnte eine Zunahme der früh-apoptotischen Zellen nach der Behandlung mit Act.D oder Eto induziert werden.

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