Korbus, Michael (2015)
Entwicklung und Charakterisierung einer photoschaltbaren Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Kontrolle von Enzymen durch einen externen Lichtstimulus ermöglicht eine präzise, orts- und zeitaufgelöste Steuerung definierter chemischer Reaktionen und demnach die Katalyse bestimmter Substrate. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung und Charakterisierung eines reversibel photoschaltbaren Biokatalysators, einer Histondeacetylase-ähnlichen Amidohydrolase (HDAH) von Bordetella/Alcaligenes Stamm FB188, welcher in einen aktiveren oder inaktiveren Zustand durch cis/trans Photoisomerisierung eines kovalent angekoppelten monofunktionalen Azobenzol-Maleimid-Derivats (4-Phenylazomaleinanil; 4-PAM) überführt werden konnte. Das lichtschaltbare Element, 4-PAM, wurde selektiv und ortsspezifisch an unterschiedlich positionierte Cysteinreste nahe der Aktivkanaleintrittsfläche angekoppelt und die sterische Blockierung des Aktivkanaleingangs anhand von Michaelis-Menten Parametern (Km und Vmax) quantifiziert. In diesem Zusammenhang konnten drei photoschaltbare HDAH-Varianten entwickelt werden (HDAH S20C, M30C und M150C), die sich in ihrer Photoschaltungseffizienz (M30C > S20C > M150C) unterschieden. Die maximal erreichbare Photoschaltungseffizienz betrug 50 % (HDAH M30C), wobei die cis-Konfiguration die HDAH aktivierte und die trans-Konfiguration zu einer Inaktivierung führte. Darüber hinaus konnte die HDAH-Aktivität in mehreren alternierenden UV/VIS-Bestrahlungszyklen ohne Einflussnahme auf die Enzymaktivität photogeschaltet und während sowie nach dem Photoschaltungsprozess keine Photozerstörung von 4-PAM nachgewiesen werden. In Bezug auf die thermische cis-zu-trans Relaxation von nicht-modifizierten 4-PAM (einphasige Kinetik) konnte an den 4-PAM/HDAH-Variant Konjugaten eine außergewöhnlich starke Verlangsamung der Relaxationsgeschwindigkeit (zweiphasige Kinetik) festgestellt werden, welche im Maximum (HDAH M30C) um das ~ 50-fache (t1/2 = ~ 30 h) reduziert wurde. Dieses besondere Merkmal ermöglichte die initiale Aktivierung des 4-PAM/HDAH-Konjugats durch einen einzigen Lichtpuls und die Aufrechterhaltung des enzymatisch aktiveren Zustands ohne kontinuierliche UV-Bestrahlung. Als Ursache für die starke Verlangsamung der cis-zu-trans Relaxation wurde eine Stabilisierung der cis-Konfiguration oder dessen Übergangszustandes an der Proteinoberfläche angenommen. Dies konnte anhand von MD-Simulationen sowie einer dazu systematischen Mutagenese-Studie an der HDAH S20C-Variante bestätigt werden. Hierbei wurde vor allem ein prominentes Histidin (H35) identifiziert, welches für die außerordentliche Stabilisierung verantwortlich war sowie die Beteiligung eines hydrophoben Clusters, bestehend aus den Aminosäuren L21, L37, P274 und L275, dessen Koordination eine essentielle Rolle in der Aufrechterhaltung der maximalen Photoschaltungseffizienz darstellte. Als involvierte intermolekulare Interaktionen zwischen dem an HDAH angekoppelten 4-PAM und relevanten Aminosäuren konnten polare, hydrophobe und vermutlich aromatische π-π Wechselwirkungen abgeleitet werden. Eine signifikante Verbesserung der Photoschaltungseffizienz der HDAH-M30C Variante (50 %) konnte durch die neuartig synthetisierten Azobenzolalkyl-Maleimid-Derivate (AMD), die Alkylspacer erweiterte 4-PAM Moleküle darstellen, nicht erzielt werden. Im Gegenzug wurde ein Alkylspacerlängen-abhängiges Verhalten auf die Enzymaktivität beobachtet, wobei AMD 1a zu einem enzymatisch inversen Schaltverhalten (trans = aktiver, cis=inaktiver) und AMDs mit Alkylspacern ≥ 3 zu einer nahezu vollständigen Inhibierung der HDAH-Aktivität führten. Ergänzend zu den photoschaltbaren Vmax-Werten zeigten die Km-Werte ebenfalls eine signifikante Photokontrolle. Darüber hinaus konnten, im Vergleich zu dem anerkannten HDAC/HDAH-Inhibitor SAHA, alle in dieser Arbeit getesteten Azobenzolderivate (4-PAM und AMD 1a-e) und dessen Isomere als nicht-potent inhibitorische Substanzen eingestuft werden.

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