Taubmann, Andreas (2015)
Untersuchung der DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur über Homologe Rekombination am Übergang von der G2-Phase in die Mitose.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Für die Erhaltung der genomischen Integrität einer Zelle ist das koordinierte Zusammenspiel von DNA-Doppelstrangbruch (DSB)-Reparatur und Zellzykluskontrolle von essentieller Bedeutung. Die Aktivierung des G2/M Checkpoints ist ein schneller Prozess, jedoch wird der Checkpoint bereits aufgehoben bevor die Reparatur abgeschlossen ist. Infolge dessen können Zellen mit einem erhöhten Level an DSBs in die Mitose eintreten. Frühere Arbeiten führten zu der Erkenntnis, dass in der späten G2-Phase DSBs überwiegend über den Weg der Homologen Rekombination (HR) repariert werden. Diese Beobachtungen ließen vermuten, dass das Aufheben des G2/M-Arrests vor Abschluss der Reparatur dazu führt, dass Zellen mit HR-Reparatur-Intermediaten in die Mitose eintreten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden DNA-Konstrukte hergestellt, welche es ermöglichen sollten, das Reparaturverhalten von HR-Faktoren (Rad51, Rad52, Rad54, Mus81) am Übergang von der G2 Phase in die Mitose genauer zu charakterisieren. Hierzu wurden basierend auf den Vektoren Zelllinien hergestellt und auf ihre Funktionalität hin untersucht. Einige der Zelllinien kamen bei der Beantwortung der nachfolgenden Fragestellung mittels Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) und Lebendzellmikroskopie zum Einsatz. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob sich diese Intermediate in der Mitose nachweisen lassen und welche Faktoren weiterhin an der Reparatur beteiligt sind. Zudem sollte ein tieferer Einblick in die Struktur der Intermediate gewonnen werden. Im Laufe dieser Arbeit konnte zunächst gezeigt werden, dass die bekannten HR-Faktoren Rad51 und Rad54 in der späten G2-Phase vom Chromatin dissoziieren und in der Mitose nicht an den DSBs lokalisieren. Im Gegensatz zu Rad51 und Rad54 ist nur wenig über die Rolle von Rad52 während der HR in Säugerzellen bekannt. Nach IR wird Rad52-GFP langsam rekrutiert und hat das Maximum zu späten Zeiten. Rad52 GFP-Foci kolokalisieren zudem in der späten G2-Phase mit Rad51-Foci und phosphoryliertem RPA (pRPA), was einen Hinweis auf eine Rolle von Rad52 in einem späten Schritt der HR liefert. Um festzustellen, ob eine Rad52 GFP-Foci-Ausbildung von vorangegangenen HR-Ereignissen abhängt, wurde Rad51 inhibiert. Interessanterweise nehmen die Foci Zahlen von Rad52-GFP und pRPA nach Rad51-Inhibition zu. Dies lässt darauf schließen, dass Rad52 auch eine Funktion unabhängig von einer vorhergehenden Rad51-Rekrutierung, dem Schlüsselschritt der HR, wahrnehmen kann. Ob diese Funktion identisch zu der zu späten Zeitpunkten in der G2-Phase in Rad51 profizienten Zellen ist, ist Gegenstand nachfolgender Projekte. Darüber hinaus sind die Rad52 Foci auch in der Pro- und in der Metaphase nachweisbar, wo sie mit der bekanntermaßen an der Auflösung sogenannter Chromatin entanglements beteiligten Nuklease Mus81 kolokalisieren. Dies bestätigt zum einen die Hypothese, dass HR-Intermediate in die Mitose eintreten, zum anderen deutet dies auf deren Auflösung hin. In der Arbeit werden verschiedene Modelle diskutiert, welche Rolle Rad52 bei der Reparatur in der späten G2 Phase und am Übergang in die Mitose einnehmen könnte.

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