DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem

Krasnyanska, Julia (2014)
DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/4081

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung des Beitrags der zur Verfügung stehenden Wege und deren Regulation bei der Reparatur der strahleninduzierten DNADoppelstrangbrüche (DSBs) im DT40‐Zellsystem. Im ersten Teil dieser Arbeit wurden die Wechselwirkungen der beiden klassischen DNA‐Doppelstrangbruch‐Reparaturwege, c‐NHEJ (canonical non‐homologous end‐joining) und HR (homologous recombination) durch den Zellzyklus untersucht. Anhand von WT und Reparaturmutanten, die einen Defekt im c‐NHEJ (Ku70‐/‐) bzw. in der HR (Rad54‐/‐) oder in beiden Reparaturwegen (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) aufweisen,wurden das klonogene Überleben und die Reparatur genauer analysiert. Mithilfe der Überlebensexperimente mit exponentiell wachsenden Zellen konnte gezeigt werden, dass die Zellen der Doppelmutante (Ku70‐/‐/Rad54‐/‐) die strahlenempfindlichste Zelllinie darstellen,was die Wichtigkeit der beiden Reparaturwege für das Überleben nach ionisierender Strahlung unterstreicht. Die Zellen der HR‐Mutante (Rad54‐/‐) zeigten eine moderate Strahlenempfindlichkeit.Interessanterweise wies die Überlebenskurve der c‐NHEJ‐Mutante (Ku70‐/‐) ein biphasisches Verhalten auf, welches sich bei niedrigen Dosen (bis 2 Gy) in einer Strahlensensitivität, bei höheren Strahlendosen (4‐10 Gy) jedoch in einer Strahlenresistenz gegenüber dem WT äußerte. Die in dieser Arbeit etablierte Messung der Zellzyklusphasenabhängigen Reparatur in DT40‐Zellen unterstützte nur partiell das aus dem Säugetierzellsystem bekannte Reparaturmodell und das biphasische Verhalten der Ku70‐/‐‐Mutante im Überlebensexperiment. Analysen der γH2AX‐Foci zeigten, dass auch im DT40‐Zellsystem das c‐NHEJ der dominante Weg für die in der G1‐Phase bestrahlten Zellen ist. Die Reparaturstudien der in der G2‐Phase bestrahlten Zellen verdeutlichen, dass trotz der hohen HR‐Frequenz in den DT40‐Zellen, das c‐NHEJ den größeren Anteil an DSBs als der Vorgang der HR beseitigt.Um einen genaueren Einblick in den Beitrag der jeweiligen Reparaturwege nach Bestrahlung in der S‐Phase zu gewinnen, wurden S‐Phase Zellen anhand spezifischer EdU-Muster in drei Untergruppen (frühe, mittlere und späte S) unterteilt. Es konnte gezeigt werden, dass die in der frühen S‐Phase bestrahlten Zellen das c‐NHEJ bevorzugt nutzen, während für die in der mittleren und späten S‐Phase bestrahlte Zellen die HR der dominierende Schritt in der Reparatur ist. Aufgrund der verbesserten Reparatur der in der mittleren SPhase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante im Vergleich zum WT, wurde angenommen,dass das c‐NHEJ für diese Zellzyklusphase keine Rolle spielt. Aufgrund der Restreparatur in der Doppelmutante konnte der Einfluss eines zusätzlichen Reparaturweges wie eines A‐EJ (alternative end‐joinig)‐Mechanismus in den DT40‐Zellen nicht ausgeschlossen werden. Die Reparaturstudien ließen vermuten, dass die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante aufgrund ihres gegenüber dem WT vorhandenen Reparaturvorteils zur verbesserten Überlebensfähigkeit beitragen. Für die Überprüfung dieser Annahme wurden die Zellzyklusphasen‐spezifische Überlebensfähigkeit und die Reparaturmessungen in synchronisierten Zellen betrachtet. Aus diesem Experiment wurde ersichtlich, dass die in der späten S/G2‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante trotz eines Reparaturdefektes eine besserere Überlebensfähigkeit als der WT aufweisen. Die in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen der c‐NHEJ‐Mutante zeigen dagegen trotz des Reparaturvorteils eine im Vergleich zum WT deutlich niedrigere Überlebensrate. Diese sich widersprechenden Ergebnisse weisen daraufhin, dass die Qualität der Reparatur ein entscheidender Faktor für die Überlebensfähigkeit der Zelle ist. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion des Proteins Artemis während der DSB-Reparatur genauer untersucht. Aus Studien mit Säugetierzellen ist bekannt, dass Artemis-defiziente Zellen empfindlich auf Strahlung reagieren und dass Artemis zusammen mit ATM an der langsamen Reparaturkomponente von strahleninduzierten DSBs sowohl in der G1‐ als auch in der G2‐Phase beteiligt ist. In der G1‐Phase beteiligt sich Artemis am c‐NHEJ. In der G2‐Phase ist es während der HR für die Reparatur heterochromatischer DSBs verantwortlich. In den Überlebensexperimenten mit DT40‐Zellen wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass Artemis‐defiziente Zelllinien strahlenempfindlich sind. Mithilfe der γH2AX‐Foci‐Analyse wurde festgestellt, dass Artemis während der Reparatur nach Bestrahlung in der G1, G2,sowie in der frühen und der späten S‐Phase wichtig ist. Dagegen läuft die Reparatur der in der mittleren S‐Phase bestrahlten Zellen in der Abwesenheit von Artemis schneller als im WT ab, was die chromosomalen Studien ebenfalls unterstützen. Die Reparatur in den Ku70‐/‐/Art‐/‐‐ sowie Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutanten verläuft nahezu in allen Zellzyklusphasen besser als in den Ku70‐/‐‐ und Rad54‐/‐‐Einzelmutanten. Die Rad54‐/‐/Art‐/‐‐Doppelmutante bildet jedoch in der G1‐Phase einen mit der Art‐/‐‐defizienten Zelllinie vergleichbaren Reparaturdefekt aus. Das Aufheben der Reparaturdefekte in der c‐NHEJ‐ und HR‐Mutante durch die Artemis‐Deletion deutet daraufhin, dass die DSBs ungehindert über alternative Mechanismen repariert werden. Diese werden insbesondere aktiviert, wenn klassische Reparaturwege fehlen. Somit scheint Artemis eine neue Funktion auszuführen, indem es als ein molekularer Schalter die Wahl der Reparaturwege, c‐NHEJ, HR und A‐EJ‐Mechanismen regelt.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2014

Autor(en):

Krasnyanska, Julia

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

DNA‐Doppelstrangbruchreparatur im DT40‐Zellsystem

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Löbrich, Prof. Dr. Markus ; Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas

Publikationsjahr:

23 Juli 2014

Ort:

Darmstadt

Datum der mündlichen Prüfung:

15 Juli 2014

URL / URN:

http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/4081

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

The present thesis is concentrated on contribution and regulation of the available DSB repair pathways in DT40 cells. The main aim of the first part was the investigation of the interactions between two classical DNA‐double strand break repair mechanisms, c‐NHEJ (canonical non‐homologous end‐joining) and HR (homologous recombination) through out the cell cycle. Using WT cells and mutants with lack of c‐NHEJ‐gene (ku70) or HR‐gene (rad54) or even of the both pathways clonogenic cell survival and DSB repair capacity were investigated. The survival assay with asynchronous cells, that are deficient in both pathways as well in c‐NHEJ as in HR, has shown the poorest survival, supporting the importance of both repair pathways for survival after ionizing radiation. The HR‐mutant had a moderate sensitivity toward the irradiation, whereas the survival of c‐NHEJ‐mutant was described by the biphasic survival curve, indicating cell cycle phase dependency. One subpopulation was more sensitive (up to 2 Gy) and the other subpopulation was more resistant (4‐10 Gy) than the WT cells. In this work the new established cell‐cycle dependent methods for evaluation of DSB repair in DT40 cells supported only partially the known mammals´ repair model and the biphasic survival curve of the c‐NHEJ mutant. By the means of γH2AX‐foci it was shown, that the c‐NHEJ is also the mostly dominant pathway in DT40 cells during repair of radiation‐induced DSBs in G1. Despite higher frequencies of HR in DT40 cells than in mammals they prefer c‐NHEJ over the HR after they irradiated in G2. For detailed analysis of contribution of repair pathways after irradiation in the S‐phase, the S‐phase cells were differentiated by various EdU-patterns in three different groups (early, middle and late S‐phase cells). c‐NHEJ is active preferentially in the cells, which are irradiated in early S. HR is the dominant repair pathway in the cells, which are irradiated in the middle or late of the S phase. The absence of c‐NHEJ in the Ku70‐/‐ cells, which are irradiated in the middle S phase, leads to more rapid repair than in WT. An other observation was that the double‐mutant cells with the absence of Ku70 and Rad54 have a slight repair, suggesting that the action of A‐EJ (alternative end‐joining) mechanisms for DSB repair can not be completely excluded. The γH2AX foci measurements in the irradiated cells in the middle of the S phase and in G2 were confirmed by cell‐cycle dependent chromosomal analysis. The repair studies implied a presumption that the middle S phase cells of c‐NHEJ mutant are the better survived subpopulation. To verify this hypothesis the measurements of repair and the cell cycle dependent survival in synchronous cells were performed. This experiment demonstrated that late S/G2 cells of c‐NHEJ mutant had abetter survival than the WT, despite the repair defect. The cells irradiated in the middle of the S phase in the c‐NHEJ mutant had a poor survival, although these cells showed less γH2AX‐foci than the WT cells. These apparently contradicting findings are the strong indication that the quality of repair is a decisive factor for the cell survival. The second part of the thesis was the investigation of the function of protein Artemis during DSB repair. From the studies with mammalian cells it is known that Artemis‐deficient cells are sensitive toward ionizing radiation. Together with ATM, Artemis is required for the slow DSB‐repair process after irradiation in G1 and G2 phases. In G1 Artemis seems to be a part of c‐NHEJ during the fast and a part of A‐EJ during the slow component. The slow repair process in G2 represents HR and repairs preferentially heterochromatic DSBs. In the present study the results of clonogenic survival assay with exponential growing cells showed that Artemis‐deficient cells are more sensitive to radiation than the WT. With γH2AX foci analysis it was demonstrated that Artemis is involved in the DSB repair after irradiation in G1, G2, early and late S phase. The Artemis‐deficient cells after irradiation in the middle of the S phase had an advantage in the repair, in comparison to WT. The repair in Ku70‐/‐/Art‐/‐‐ and Rad54‐/‐/Art‐/‐‐double‐mutants had an improved repair after irradiation in all cycle phases compared with Ku70‐/‐‐ and Rad54‐/‐‐single‐mutants. The Rad54‐/‐/Art‐/‐‐double‐mutant showed a comparable repair defect with Art‐/‐‐single‐mutant after irradiation in G1. The abrogation of repair defects in the c‐NHEJ‐ and HR‐mutant after deletion of Artemis is indicating that DSBs can be repaired unhampered by alternative repair pathways, which are more activated, if classical repair pathways are absent. These findings are suggesting a new function of Artemis as a molecular switch for regulating the choice between repair pathways, like HR, c‐NHEJ and A‐EJ‐mechanisms.

Englisch

Freie Schlagworte:

DT40-Zellen, DSB-Reparatur, Zellzyklus

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