Tavlaridou, Stella (2014)
Interaktionen und Aggregationsverhalten von akzessorischen Gasvesikelproteinen bei der Gasvesikelbildung in Haloarchaea.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 wird durch die Expression der p-vac Region vermittelt. Sie besteht aus zwei entgegengesetzt orientierten Genclustern gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM. Als Strukturproteine der Gasvesikel wurden GvpA und GvpC identifiziert. GvpA bildet über Multimerisierung die gaspermeable Hülle, die von GvpC an der Außenseite stabilisiert wird. GvpA, F, G, J, K, L, M und O sind für die Bildung von Gasvesikeln essentiell. Die Gene gvpFGHIJKLM werden in der frühen, exponentiellen Wachstumsphase und vor dem Sichtbarwerden von bikonischen Proteinaggregaten, den Vorläuferstrukturen der Gasvesikel, transkribiert. Daher geht man davon aus, dass die entsprechenden Genprodukte bei der Initation der Gasvesikelbildung eine Rolle spielen. Die genaue Funktion dieser sogenannten akzessorischen Gasvesikelproteine ist jedoch noch unklar. In dieser Arbeit wurde die Rolle der akzessorischen Gasvesikelproteine GvpF, G, H, I, J, K, L und M bei der Gasvesikelbildung in Hbt. salinarum PHH1 untersucht. Dabei lag der Schwerpunkt auf der Analyse der Protein-Protein-Interaktionen und des Aggregations-verhaltens der Gasvesikelproteine. Zunächst wurde der Effekt einer Überproduktion eines einzelnen Gasvesikelproteins in p-vac-Transformanten analysiert. Zur Überproduktion wurde dabei der Expressionsvektor pJAS35 verwendet, der den inserierten gvp-Leserahmen unter Kontrolle des starken Ferredoxin-Promotors exprimiert. Die Überproduktion von GvpG, H oder M führte zu einer Inhibition der Gasvesikelbildung, während erhöhte Mengen von GvpF, I, J, K oder L keinen Effekt hatten. Eine mögliche Erklärung für die reduzierte Gasvesikelbildung in p-vac +pGex-, +pHex- oder +pMex-Transformanten ist, dass die großen Mengen von GvpG, H oder M mit anderen, nur in geringer Menge vorhandenen, essentiellen Gasvesikelproteinen interagieren und diese dann nicht mehr für die Gasvesikelbildung zur Verfügung stehen. Die Überproduktion von mehreren akzessorischen Gasvesikelproteinen stört die Gasvesikelsynthese dagegen nicht, wie der Vac positive Phänotyp von p-vac +pGHIJKLMex-Transformanten zeigte. Offenbar muss die relative Menge bestimmter, akzessorischer Gasvesikelproteine zueinander in einem bestimmten Verhältnis stehen, um eine intakte Gasvesikelbildung zu gewährleisten. Am Beispiel von GvpM wurde getestet, ob die gleichzeitige Produktion ähnlich großer Mengen eines weiteren einzelnen Gasvesikelproteins in der Lage ist, die inhibitorische Wirkung von GvpM zu kompensieren. Hierfür wurden p-vac +pGMex-, +pHMex-, +pJMex- und +pLMex-Transformanten hergestellt und bezüglich der Bildung von Gasvesikeln untersucht. Die inhibitorische Wirkung großer Mengen von GvpM auf die Gasvesikelbildung kann durch vergleichbar große Mengen von GvpH, GvpJ oder GvpL neutralisiert werden, jedoch nicht durch vergleichbar große Mengen von GvpG. Eine intakte Gasvesikelbildung setzt also ein balanciertes Mengenverhältnis von GvpM zu GvpH, GvpJ oder GvpL voraus. Die Western-Analysen mit pHMex und pJMex zeigten bei Verwendung eines Antiserums gegen GvpH bzw. GvpJ neben dem Protein-Monomer zusätzlich größere Proteinbanden. Dies lässt eine Multimerisierung in Gegenwart von GvpM bzw. eine Interaktion mit GvpM vermuten. Mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie konnte eine Interaktion zwischen GvpHHis und GvpM, GvpLHis und GvpM sowie GvpMHis und GvpJ in vitro mit in Hochsalz rückgefalteten GvpHis-Proteinen nachgewiesen werden, nicht jedoch zwischen GvpMHis und GvpG. In dieser Arbeit wurden auch die Aggregationen von Gasvesikelproteinen in vivo durch Fusion mit einer speziell an Hochsalzbedingungen adaptierten GFP-Variante detektiert. Bei GvpMGFP wurden fluoreszierende Punkte in der Zelle beobachtet, was die starke Aggregation von GvpM unterstreicht. Bei GvpHGFP zeigte sich, dass dieses normalerweise lösliche Protein in Gegenwart der p-vac-Proteine in Aggregaten vorliegt. Für GvpM-GvpH und GvpM-GvpL konnte die Interaktion dieser Proteinpaare mit den entsprechenden GFP-Varianten direkt in vivo nachgewiesen werden. Die Interaktion von GvpM und GvpH führt offenbar dazu, dass GvpMGFP keine detektierbaren Aggregate mehr bildet. In Gegenwart von GvpL sind weiterhin GvpM-Aggregate vorhanden und GvpL ist in diese Aggregate integriert. Möglich wäre, dass diese Interaktionen zur Bildung eines Initiationskomplexes führen, der zur Gasvesikelbildung benötigt wird. Sowohl GvpH als auch GvpL kompensieren, vermutlich durch Interaktion mit GvpM, die inhibitorische Wirkung großer Mengen von GvpM auf die Gasvesikelbildung, jedoch durch unterschiedliche Mechanismen. Im letzten Teil dieser Arbeit wurden GvpM-Mutanten und ihr Einfluss auf die Gasvesikelbildung untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass vor allem hydrophobe Aminosäuren im N-terminalen und mittleren Bereich des Proteins für dessen Funktion essentiell sind. Da keine der Mutationen die Morphologie der Gasvesikel veränderte, ist GvpM wahrscheinlich nicht an der Formgebung der Gasvesikel beteiligt, sondern spielt bei der Initation der Gasvesikelbildung eine wichtige Rolle.

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