Untersuchung der DNA-Schadensantwort in der murinen Retina nach ionisierender Strahlung

Frohns, Antonia (2013)
Untersuchung der DNA-Schadensantwort in der murinen Retina nach ionisierender Strahlung.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3638

Kurzbeschreibung (Abstract)

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) können sowohl durch die Einwirkung ionisierender Strahlung als auch durch andere exogene und endogene Faktoren erzeugt werden. Die Reparatur von DSBs ist ein entscheidender Prozess zur Aufrechterhaltung der genomischen Integrität eines Organismus. Die zelluläre Schadensantwort auf DSBs, bei der es zur Phosphorylierungen von Histonen (z.B. H2AX) und zur Akkumulation von Signalproteinen (z.B. pATM und 53BP1) um den Bereich von DSBs kommt, kann Zelltyp-spezifische Unterschiede aufweisen. Darüber hinaus wurde in den letzten Jahren immer deutlicher, dass auch die Chromatinorganisation einen entscheidenden Einfluss auf die Erkennung und Reparatur von DSBs hat. In der vorliegenden Arbeit wurde die Schadenserkennung sowie die Reparatur von DSBs in der Retina der Maus untersucht, welche im adulten Stadium ein vergleichsweise einfach aufgebautes Gewebe mit einer geringen Anzahl an Zelltypen mit unterschiedlichen Chromatinstrukturen darstellt. Mit Hilfe der H2AX-Foci-Analyse und der Methode der Pulsfeldgelelektrophorese konnte festgestellt werden, dass die Stäbchen-Photorezeptoren (Stäbchen-PRs) der Retina adulter Wildtyp (WT)-Mäuse, bei denen das Heterochromatin (HC) in einem einzigen zentral gelegenen Chromocenter angeordnet ist, einen Reparaturdefekt von durch Röntgenstrahlung erzeugten DSBs aufweisen, der sich über mehrere Tage beobachten lässt. Dieser bislang unbekannte Reparaturdefekt konnte weder in anderen Zelltypen der adulten Retina noch in Zellen der Niere, des Gehirns oder in den noch nicht ausdifferenzierten Vorläuferzellen der Stäbchen-PRs postnataler WT-Mäuse (P4) beobachtet werden, bei denen eine konventionelle Chromatinorganisation vorliegt. Interessanterweise weisen weder die Stäbchen-PRs noch die Zapfen-PRs oder die Bipolarzellen der Retina adulter WT-Mäuse eine effiziente Akkumulation von 53BP1 und pATM an strahleninduzierte DSBs auf, obwohl ausschließlich in den Stäbchen-PRs ein Reparaturdefekt von DSBs nach Bestrahlung gezeigt werden konnte. Die Beobachtung, dass in DNA-PK-defizienten SCID-Mäusen eine strahleninduzierte Phosphorylierung von H2AX trotz ausbleibender Akkumulation von pATM stattfindet, deutet darauf hin, dass pATM in diesen Zelltypen dennoch vorhanden ist, da die H2AX-Phosphorylierung in diesen Zellen ausschließlich von ATM und DNA-PK durchgeführt wird. In Studien mit ATM-defizienten AT-Mäusen konnte gezeigt werden, dass der Level an verbleibenden DSBs in den Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse vergleichbar ist mit dem von AT-Mäusen. Die ATM-Defizienz führt zu einer ausbleibenden Phosphorylierung des Heterochromatin-bildenden Faktors KAP1 und einer damit verbundenen fehlenden Relaxation des Chromatins nach Bestrahlung. Dadurch kommt es zu einem Defekt in der Reparatur heterochromatischer DSBs. Auch in den Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse konnte im Rahmen dieser Arbeit eine fehlende Phosphorylierung von KAP1 nach Bestrahlung nachgewiesen werden. In den Zapfen-PRs und den Bipolarzellen der Retina adulter WT-Mäuse, in denen ebenfalls keine effiziente Akkumulation von pATM und 53BP1 an den DSBs zu beobachten war, konnte dagegen eine Phosphorylierung von KAP1 gezeigt werden. Der Reparaturdefekt in Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse korreliert also sowohl mit der einzigartigen Chromatinstruktur als auch mit der fehlenden strahleninduzierten Phosphorylierung von KAP1 in diesem Zelltyp. Da bereits in vorangegangenen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass sich DSBs innerhalb des Chromatins bewegen können, wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit der Transport strahleninduzierter DSBs nach Bestrahlung mit Schwerionen in Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse untersucht. Diese Experimente zeigten, dass auch in diesem Zelltyp bereits kurz nach Bestrahlung ein Transport strahleninduzierter DSBs stattfindet. Des Weiteren wurde die Lokalisation strahleninduzierter H2AX-Foci innerhalb des Chromatins der Stäbchen-PRs während der Reparatur nach Röntgenstrahlung analysiert. Dabei wurde ebenfalls die Beteiligung der Kinasen ATM und DNA-PK bei der Phosphorylierung von H2AX innerhalb verschiedener Chromatin-Bereiche untersucht. Zusätzlich zu den in vivo-bestrahlten WT-, AT- und SCID-Mäusen wurden dafür ex vivo-kultivierte Retina-Explantate verwendet, welche mit Inhibitoren für ATM und DNA-PK behandelt wurden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass H2AX in den ersten Minuten nach Bestrahlung überwiegend im Euchromatin (EC) aber zum Teil auch im fakultativen HC phosphoryliert wird. Erst mehrere Minuten nach Bestrahlung konnte auch im konstitiutiven HC eine Phosphorylierung von H2AX beobachtet werden. Es stellte sich heraus, dass die innerhalb der ersten Minuten überwiegend im EC auftretende Phosphorylierung von H2AX ATM-abhängig ist. Im weiteren Verlauf können sowohl ATM als auch DNA-PK die Phosphorylierung von H2AX durchführen. Dabei liefert diese Arbeit erstmals Hinweise darauf, dass die DNA-PK für die Phosphorylierung von H2AX im konstitutiven HC verantwortlich zu sein scheint. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Retina der Maus in dieser Arbeit als ein neues in vivo-Modell für die Reparatur strahleninduzierter DSBs etabliert wurde. Da die Retina ein im Gegensatz zum restlichen Gehirn einfach aufgebautes und schnell zugängliches Gewebemodell darstellt, kann diese in Zukunft zum besseren Verständnis für die Zelltyp-spezifischen Vorgänge nach Einwirkung ionisierender Strahlung im zentralen Nervensystem beitragen. Mit den Stäbchen-PRs als dominierendem Zelltyp bietet die Retina von Mäusen außerdem ein gutes Modellsystem für die Analyse der DSB-Reparatur im HC, sowie für die Untersuchung der Transportmechanismen von DSBs in verschiedenen Chromatin-Bereichen. Durch die Beobachtung, dass in den Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse ein Defekt in der Reparatur strahleninduzierter DSBs auftritt, konnte erstmals nachgewiesen werden, dass die Chromatinorganisation auch bei Säugern in vivo eine entscheidende Rolle bei der DSB-Reparatur spielt.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2013

Autor(en):

Frohns, Antonia

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

Untersuchung der DNA-Schadensantwort in der murinen Retina nach ionisierender Strahlung

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Löbrich, Prof. Dr. Markus ; Thiel, Prof. Dr. Gerhard

Publikationsjahr:

23 Juli 2013

Ort:

Darmstadt

Datum der mündlichen Prüfung:

20 September 2013

URL / URN:

http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3638

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

DNA double-strand break (DSB) repair is a crucial process for the maintenance of genomic stability after exposure to ionizing radiation (IR) and other exogenous and endogenous factors. The cellular response to DSBs, including phosphorylation of histones (e.g. H2AX) and accumulation of signal proteins (e.g. pATM and 53BP1) at the break sites, depends on cell type-specific differences, with chromatin organization representing one important factor influencing DSB repair. In this work, the DNA damage signaling as well as the DSB repair was analyzed after IR within the murine retina, as a simple organized tissue with a low number of cell types. Furthermore, rod photoreceptors (rods) as the predominant cell type of the murine retina exhibit a unique chromatin structure with a single central heterochromatin cluster which arises by fusion of several smaller clusters during postnatal development. Strikingly, rods of wildtype (wt)-mice exhibited a pronounced DSB repair defect after IR, detected by H2AX foci analysis and pulsfeld gel electrophoresis, which could neither be observed within other cells of the adult retina, brain or kidney, nor in still undifferentiated rod progenitors of postnatal mice (P4). An analysis of the initial DNA damage signaling within the different retinal cell types revealed an inefficient accumulation of pATM and 53BP1 at the sides of DSBs within repair-impaired rods. Interestingly, this inefficient accumulation of pATM and 53BP1 could also be observed in repair-proficient cone-photoreceptors (cones) and bipolar cells, which exhibit a normal chromatin structure. However, despite the inefficient accumulation of pATM at the sides of DSBs in these cells, DNA-PK deficient mice (SCID-mice) show robust H2AX phosphorylation after IR in the whole retina. This confirms that pATM is present and functional in all cell types, since phosphorylation of H2AX can only be carried out by ATM or DNA-PK in resting neuronal cells. Additional irradiation experiments with ATM-deficient mice (AT-mice) show a prominent DSB repair defect comparable to that of rods in wt-mice. This is ascribed to unrepaired heterochromatic DSBs due to the missing phosphorylation of the heterochromatin building factor KAP1 by ATM and the subsequent lack of chromatin relaxation. Further analysis showed a comparable lack of KAP1 phosphorylation within wt rods after IR. In contrast, cones and bipolar cells, which both showed an inefficient accumulation of pATM at the sites of DSBs, but a normal DSB repair, exhibited robust KAP1 phosphorylation. Thus, the striking DSB repair defect within rods of adult mice closely correlates with the unique chromatin structure as well as the missing phosphorylation of KAP1. Earlier work demonstrates that radiation induced DSBs can move within chromatin. For this reason the transport of IR-induced DSBs after heavy ion irradiation was investigated in rods of wt-mice. Thereby, a rapid transport of DSBs could be detected within few minutes after irradiation. Furthermore, the localization of IR-induced H2AX foci within chromatin of wt-rods was studied during repair. Thereby the contribution of ATM and DNA-PK to the phosphorylation of H2AX within the different chromatin compartments was analyzed. By using in vivo irradiation of WT-, AT- and SCID mice as well as ATM- or DNA-PK inhibitor treated retinal explants, a faster phosphorylation of H2AX within euchromatin and facultative heterochromatin was revealed, when compared to constitutive heterochromatin. Furthermore, ATM was identified as the faster kinase, phosphorylating H2AX exclusively within the first few minutes after irradiation. At later time points ATM and DNA-PK both phosphorylate H2AX with the exception of the constitutive heterochromatin, where H2AX was nearly exclusively phosphorylated by DNA-PK. To summarize, during this work the murine retina was established as a new model for the analysis of radiation-induced DSBs in vivo. Since this tissue represents a comparably simple organized part of the central nervous system that can be isolated very fast after IR, it might become a suitable model to gain better insights in the radiation response of different cell types of the brain. Furthermore, with highly heterochromatic rods as a predominant cell type, it offers a unique possibility to study the mechanisms of mammalian DSB repair within different compartments of chromatin, which was shown in this work for the first time to affect DSB repair in vivo.

Englisch

Freie Schlagworte:

Retina, DNA, Doppelstrangbruch, Heterochromatin

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