Ebel, Christian (2013)
Studien zur Reparatur Camptothecin- und Methylmethansulfonat-induzierter DNA-Schäden.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Agenzien Camptothecin (CPT) und Methylmethansulfonat (MMS) werden aufgrund ihrer DNA-schädigenden Wirkung seit vielen Jahren untersucht. Vor allem in proliferierenden Zellen konnte dabei eine verstärkte Induktion von DNA-Schäden beobachtet werden, was zum Einsatz dieser Agenzien als Chemotherapeutika zur Behandlung von Krebserkrankungen führte. CPT ist ein Inhibitor, welcher eine Topoisomerase-katalysierte Religation von Einzelstrangbrüchen (SSBs) verhindert, wohingegen MMS ein Alkylanz ist, welches Basenmethylierungen an diversen Stellen im Genom verursacht. Basenmethylierungen werden durch den Mechanismus der Basenexzisionsreparatur behoben, wobei ebenfalls temporär SSBs entstehen. Die Wirkung von CPT und MMS wird auf eine massive Ausbildung von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSBs) in der S-Phase des Zellzyklus zurückgeführt, welche durch die Interferenz aktiver Replikationsgabeln mit SSBs induziert werden. Da DSBs den schwerwiegendsten Schaden für die genomische Integrität einer Zelle darstellen, haben sich Mechanismen entwickelt, welche DSBs effizient reparieren können. In der S-Phase wird die Reparatur jedoch durch die gleichzeitige Replikation der DNA verkompliziert. Außerdem können während der Replikation ein-endige DSB-Strukturen entstehen, welche sich von zwei-endigen DSBs unterscheiden. Die Reparatur von zwei-endigen DSBs, welche zum Beispiel durch ionisierende Strahlung verursacht werden können, ist vergleichsweise gut erforscht. So wird der Großteil dieser zwei-endigen DSBs in der G1- und G2-Phase des Zellzyklus durch die Nichthomologe-Endverknüpfung (NHEJ) bewerkstelligt, wobei in der G2-Phase zusätzlich die Homologe Rekombination (HR) einen Teil der DSBs repariert. Die HR bedient sich dabei bereits replizierter DNA als Vorlage zur Reparatur des geschädigten Bereichs auf dem Schwesterchromatid. Obwohl in der S-Phase je nach Fortschritt der Replikation womöglich keine Kopie eines geschädigten DNA-Bereichs vorliegt, konnte in den letzten Jahren beobachtet werden, dass die HR gerade für die Reparatur replikationsassoziierter DNA-Schäden eine große Rolle spielt. So ist es nicht verwunderlich, dass HR-defiziente Zellen besonders sensitiv auf Behandlungen mit MMS oder CPT reagieren, welche gezielt die Replikation von Zellen stören und in der S-Phase zu ein-endigen DSBs führen. HR-defiziente Zellen zeigen ein vermindertes Überleben und erhöhte chromosomale Aberrationen nach einer CPT- oder MMS-Behandlungen. Die molekularen Mechanismen sowohl der Entstehung von CPT- und MMS- induzierten DSBs als auch der Reparatur sind bis heute noch nicht vollständig aufgeklärt. Die vorliegende Arbeit konnte mittels sensibler und zellzyklusspezifischer Analysen zunächst die Entstehung von CPT- und MMS-induzierten DSBs auf Einzelzellebene durch die Bildung von γH2AX-Foci in der S-Phase nachweisen. Desweiteren konnte eine HR-abhängige Reparatur der CPT- und MMS-induzierten DSBs bestätigt werden, wobei im Gegensatz zu beschriebenen Studien eine Beteiligung des NHEJs ausgeschlossen werden konnte. Anhand der Analyse von Schwesterchromatidaustauschen (SCEs) sowohl in humanen als auch Basenexzisionsreparatur (BER) -defekten, murinen Zellen konnte gezeigt werden, dass CPT und MMS während der Replikation DNA-Strukturen erzeugen, welche γH2AX-negativ sind und dennoch zur Ausbildung von SCEs führen. Diese Strukturen werden wahrscheinlich durch arretierte Replikationsgabeln hervorgerufen, welche durch CPT und MMS vermehrt induziert werden und so zu einer fork regression und Ausbildung von chicken foot-Strukturen führen können. Die Auflösung dieser Strukturen benötigt HR-Prozesse und kann ohne die Ausbildung von γH2AX-Foci zu crossover-Ereignissen und SCEs führen. Durch den innovativen Ansatz der kombinierten Life cell/γH2AX-Foci-Analyse konnte beobachtet werden, dass CPT DSBs in Abhängigkeit von der Aufenthaltsdauer von Zellen in der S-Phase induziert. Hieraus konnte geschlussfolgert werden, dass die Anzahl an induzierten DSBs direkt mit der Replikationsaktivität einer Zelle zusammenhängt und deshalb die in zellzyklusspezifischen Experimenten beobachtete Varianz der Anzahl an induzierten DSBs von Zellen stammt, welche unterschiedlich lange unter dem Einfluss von S-Phase-schädigenden Agenzien in der S-Phase standen. Mit durchflusszytometrischen Studien konnte das Zellzyklusverhalten von CPT- und MMS-behandelten Zellen analysiert werden, wobei festgestellt wurde, dass sowohl CPT als auch MMS zu einer Verzögerung der S-Phase-Progression und Akkumulation von Zellen mit doppeltem DNA-Gehalt führen. Dies resultierte in einer verminderten Progression von behandelten Zellen in die G1-Phase. Wurden zelluläre Checkpoint-Signale bereits innerhalb der S-Phase durch eine zusätzliche Koffein-Behandlung aufgehoben, so zeigten CPT-behandelte Zellen eine Beschleunigung der Progression, wohingegen MMS-behandelte Zellen nicht durch die Gabe von Koffein in Ihrer Progression beeinflusst wurden. Dies ließ im Fall von MMS auf einen Checkpoint-unabhängigen Mechanismus schließen, welcher Zellen in der S-Phase verlangsamt. Obwohl CPT und MMS in der Literatur als starke Klastogene beschrieben wurden, konnten in mitotischen Zellen, die zuvor in der S-Phase unter dem Einfluss von CPT oder MMS standen, weder erhöhte γH2AX-Foci-Level noch erhöhte Chromatidbruchraten detektiert werden. Selbst unter Suppression des essentiellen HR-Faktors RAD51 konnten vergleichsweise wenige induzierte γH2AX-Foci oder Chromatidbrüche in CPT- oder MMS-behandelten Zellen festgestellt werden. Erst durch eine zusätzliche Aufhebung des G2/M-Checkpoints konnte bei einer RAD51-Defizienz eine massive Klastogenität der beiden Agenzien in mitotischen Zellen beobachtet werden, sodass davon ausgegangen werden kann, dass Zellen höchst-effektive Mechanismen entwickelt haben, um replikationsassoziierte DNA-Schäden noch vor der Progression in die Mitose zu reparieren oder falls dies nicht möglich ist, eine Progression mit DSBs in die Mitose zu unterbinden. Womöglich können Zellen auf replika-tionsabhängige DNA-Schäden wesentlich besser reagieren als auf DNA-Schäden in der G1- oder G2-Phase, da die S-Phase den größten Quell endogener DNA-Schäden darstellt. Um herauszufinden, wann CPT- und MMS-induzierte DNA-Schäden repariert werden, wurden in der vorliegenden Arbeit neben den zytogenetischen Studien mitotischer Zellen zusätzlich Analysen von frühzeitig kondensierten Chromosomen der G2-Phase (G2-PCCs) durchgeführt. Die Ergebnisse ließen zusammen mit den Zellzyklusanalysen und den Life cell-Studien auf eine RAD51-vermittelte Arretierung von CPT- oder MMS-geschädigten Zellen in einer späten S-Phase schließen, da RAD51-profiziente Zellen keine erhöhten Chromatidbruchlevel in der G2-Phase aufwiesen. Mit einer RAD51-Defizienz hingegen progressierten Zellen mit unreparierten DSBs in die G2-Phase, wo sie mittels der PCC-Analyse in Form von Chromatidbrüchen detektiert werden konnten. Zusammenfassend weisen die in der vorliegenden Arbeit erlangten Ergebnisse auf eine Funktion von RAD51 in einer Checkpoint-unabhängigen Arretierung von CPT- oder MMS-behandelten Zellen zu einem späten Zeitpunkt der S-Phase hin. Dabei konnte gezeigt werden, dass RAD51 die Progression von Zellen mit CPT- oder MMS-induzierten DSBs in die G2-Phase verhindert. Ohne RAD51 progressieren Zellen mit erhöhten DSB-Raten in die G2-Phase, jedoch nicht in die Mitose, da der G2/M-Checkpoint die Progression geschädigter Zellen verhindert. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass sowohl CPT als auch MMS Strukturen erzeugen, welche nicht zur Ausbildung von „freien“ DSBs und damit zu γH2AX-Foci führen, allerdings HR-vermittelt aufgelöst werden und zur Entstehung von SCEs beitragen. Außerdem induziert MMS im Gegensatz zu CPT eine massive Anzahl an Methylierungen, welche zusätzlich zu einer Checkpoint-unabhängigen Verzögerung der S-Phase-Progression führen.

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