Beuke, Marcus (2013)
Untersuchung zur Relokalisierung heterochromatischer DNA Läsionen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die DNA in Säugerzellen ist um Histone gewunden und faltet sich zu höher geordneten Strukturen, welche man als Chromatin bezeichnet. Dieses wird in zwei Klassen aufgeteilt: das locker gepackte, transkriptionell aktive Euchromatin und das dicht gepackte heterochromatin (HC). Letzteres ist transkriptionell inaktiv, aber von entscheidender Bedeutung für die Regulation der Genexpression und die gesamte nukleäre Architektur. Obwohl das Heterochromatin durch seine dichte Packung eine besondere Herausforderung für die DNA Reparatur darzustellen scheint, ist wenig bekannt über den Ablauf der heterochromatischen Reparatur. In den meisten Studien wird nicht zwischen Eu- und Heterochromatin differenziert und da letzteres nur einen Anteil von etwa 20 % des Säugergenoms ausmacht, gehen die speziellen Anforderungen dieses besonderen Chromatinbereichs in solchen Studien unter. Durch die Verwendung gezielter Ionenbestrahlung wurde in dieser Arbeit die Relokalisierung heterochromatischer DNA Schäden aus den Chromocentern muriner Fibroblasten charakterisiert. Außerdem konnte gezeigt werden, dass das getroffene Chromatin nach gezielter schwerionenbestrahlung innerhalb von Sekunden dekondensiert. Die DNA Schäden wurden neben der Immunofluoreszenzmarkierung von Reparaturproteinen auch durch den direkten Nachweis mit Hilfe einer modifizierten TUNEL Analyse detektiert. Die Schäden relokalisieren innerhalb von etwa 20 Minuten aus dem Heterochromatin (HC) heraus. Dabei verliert das geschädigte Chromatin einen Teil seiner HC Marker wie H3K9me3, während andere HC Marker wie HP1α erhalten bleiben bzw. zusätzlich zu dem bereits gebundenen Anteil an den DNA Schaden rekrutiert werden. Der Prozess der Relokalisierung erwies sich als unabhängig von der Zellzyklusphase. Auch der LET (Linearer Energie Transfer) des Ions hatte keinen messbaren Einfluss auf die Relokalisierung. Darüber hinaus ließ sich diese auch nach Röntgenbestrahlung beobachten. Durch Relokalisierungsanalysen in ATM (Ataxia telangiectasie mutated) defizienten Fibroblasten konnte jedoch belegt werden, dass die Geschwindigkeit der Relokalisierung von ATM abhängt. Allerdings läuft der generelle Prozess grundsätzlich auch ohne diese Kinase ab. Der Heterochromatin-bildende Faktor KAP1, der mit der schadensinduzierten, ATM abhängigen Chromatindekondensation in Verbindung gebracht wurde, zeigte sich als unbedeutend für die Geschwindigkeit der Relokalisierung. So ließ sich die Relokalisierungsverzögerung in ATM defizienten Zellen nicht durch einen KAP1 knock down kompensieren. Neben ATM zeigten sich auch die anderen PIKK-Familien-Mitglieder ATR und DNA-PK für die Geschwindigkeit der Relokalisierung von Bedeutung. Die Kinasen scheinen dabei nicht vollständig redundant zu agieren. So hatte die DNA-PK Inhibition in ATM defizienten Zellen einen zusätzlich verlangsamenden Effekt auf die Relokalisierung. Dennoch konnte kein Hinweis darauf gefunden werden, dass die drei untersuchten PIK Kinasen einen Einfluss auf die Ausprägung der Dekondensation haben. Durch Immunofluoreszenzanalysen konnte gezeigt werden, dass die Reparatur heterochromatinassoziierter Schäden langsamer abläuft als die Reparatur euchromatischer Schäden und dass diese langsam reparierenden DNA Läsionen fast ausnahmslos mit Resektion assoziiert sind. Auch nach gezielter Bestrahlung von Chromocentern konnte die Resektion der ioneninduzierten DNA Schäden bereits innerhalb des Heterochromatins nachgewiesen werden. Der Resektionsmarker RPA war dabei oft von dem NHEJ (non homologous end joining) Faktor 53BP1 umgeben, ohne aber dass die beiden Proteine kolokalisierten. Diese spezielle Focusstruktur konnte auch mit Hilfe von hochauflösender Mikroskopie bestätigt werden und spricht für eine Konkurrenz der Reparaturwege um die DNA Schäden. Bei den hier beschriebenen Reparaturfocusstrukturen könnte es sich um sogenannte Reparaturzentren handeln, in denen mehrere DNA Schäden, wie sie entlang einer Ionentrajektorie entstehen, zusammen gezogen werden. Die Untersuchungen in dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die DNA Schadensantwort im Heterochromatin und in die Reparatur heterochromatischer DNA Schäden.

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