Neue Miniproteininhibitoren gegen die humane Typ II Transmembranserinprotease Matriptase (MT-SPI)

Tomaszowski, Michael (2013)
Neue Miniproteininhibitoren gegen die humane Typ II Transmembranserinprotease Matriptase (MT-SPI).
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3434

Kurzbeschreibung (Abstract)

In dieser Arbeit sollten neue Miniproteininhibitoren gegen die humane Typ II Transmembranserinprotease Matriptase (MT-SP1) mittels rationalen Protein Design oder gerichteter Evolution durch die Methode des yeast surface display gefunden werden. Zunächst sollte die Eignung der natürlichen MCoTI Varianten als Inhibitoren der Matriptase untersucht werden. Dazu wurden diese aus den Samen von Momordica cochinchinensis isoliert und die katalytische Domäne rekombinant in E.coli produziert und aufgereinigt. Anschließend erfolgte die Bestimmung der Inhibitionskonstanten gegen Matriptase. Dabei stellte sich MCoTI-II (Kiapp 235 nM) als geeignetes Miniprotein heraus und wurde in den folgenden Abschnitten als scaffold für neue Inhibitoren verwendet. Anschließend wurden durch rationales Protein Design am Computer verschiedene Positionen im Miniprotein identifiziert und durch Peptidfestphasensynthese neue Aminosäuren an diesen Stellen eingefügt und auf ihre Inhibition gegen Matriptase hin untersucht, um Varianten mit einer niedrigeren Kiapp zu erhalten. Diese Experimente lieferten jedoch keine Varianten des Miniproteins mit verbesserten Inhibitionseigenschaften und lassen diese Methode nur bedingt geeignet erscheinen, neue Proteaseinhibitoren basierend auf oMCoTI-II zu finden. Anschließend wurden zunächst zwei unterschiedliche kombinatorische Bibliotheken auf Basis von oMCoTI-II mit Diversitäten von 1E+7 und 2E+7 in S. cerevisiae erzeugt. Die beiden Bibliotheken wurden im yeast surface display separat gegen Matriptase mittels fluorescence asisted cell sorting (FACS) mehreren Selektionsrunden durchmustert. Dabei wurde stetig die Antigenkonzentration verringert, um auf hochaffine Inhibitoren zu selektieren. In der anschließenden Analyse konnten mehrere Varianten mit unterschiedlichen Aminosäurensequenzen identifiziert werden. Daraus wurden einige Miniproteine ausgewählt, mittels Peptidfestphasensynthese dargestellt und ihre apparenten Inhibitionskonstanten bestimmt. Es konnten zwei Miniproteinvarianten mit hohen Affinitäten und unterschiedlichen Sequenzen gegen Matriptase (Kiapp 3,7 und 8,7 nM) identifiziert werden.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2013

Autor(en):

Tomaszowski, Michael

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

Neue Miniproteininhibitoren gegen die humane Typ II Transmembranserinprotease Matriptase (MT-SPI)

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Kolmar, Prof. Dr. Harald

Publikationsjahr:

2013

Datum der mündlichen Prüfung:

29 Oktober 2012

URL / URN:

http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3434

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

In this study novel miniprotein inhibitors against the human type II transmembrane serine protease matriptase (MT-SP1) should be identified. Therefor the two different methods of protein engineering, rational protein design and directed evolution have been applied to the miniprotein scaffold. For the directed evolution approach the technique of yeast surface display has been used. First the suitability of the natural occurring miniprotein variants of MCoTI as inhibitors against matripase has been tested. The miniprotein variants have been isolated from the seeds of Momordica cochinchinensis. Next the inhibition constants of those variants against the catalytic domain of matriptase, which has been produced and purified from E.coli, were determined. It turned out that MCoTI-II with a Kiapp of 235 nM is the best variant and therefore it has been used as a scaffold for the identification of novel miniprotein inhibitors in the following parts of this study. In the next step different positions for an amino acid exchange in the miniprotein have been identified with the rational protein design method. The amino acids exchanges were introduced into the miniprotein via solid phase peptide synthesis to obtain variants with higher affinity against matriptase. Determination of the inhibition constants showed that these experiments did not yield miniprotein variants with a higher affinity against matriptase. In the next step the directed evolution method has been applied to MCoTI-II. Therefor two combinatorial libraries, with diversities of 1E+7 and 2E+7, have generated in S.cerevisiae. These two libraries have been sorted against decreasing concentrations of matriptase using the technique of yeast surface display and fluorescence assisted cell sorting (FACS). A subset of miniprotein variants from these selections has been produced via solid phase peptide synthesis and their inhibition constants have been determined. From this method of protein engineering two novel miniprotein inhibitors against the human type II transmembrane serine protease matriptase with high affinities (Kiapp 3,7 nM and 8,7 nM) could be identified.

Englisch

Freie Schlagworte:

Miniprotein, yeast surface display, MCoTI-II, Matriptase

URN:

urn:nbn:de:tuda-tuprints-34349

Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC):

500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie

Fachbereich(e)/-gebiet(e):

07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie

Hinterlegungsdatum:

02 Jun 2013 19:55

Letzte Änderung:

02 Jun 2013 19:55

PPN:

Referenten:

Kolmar, Prof. Dr. Harald

Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung:

29 Oktober 2012

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