Kalweit, Anne (2013)
Kinetische Untersuchungen zum Zusammenhang von Sequenz, Struktur und Funktion der Hammerhead Ribozyme.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Das Hammerhead Ribozym (HHRz) ist die kleinste bekannte katalytische RNA und katalysiert die Spaltung und Ligation des eigenen Phosphordiesterrückgrads durch eine Umesterungsreaktion (SN2-Reaktion; Lilley, 2003). Die Minimalstruktur der HHRz besteht aus einer hochkonservierten katalytischen Core-Region und drei flankierenden Helices mit variablen Längen. Natürlich vorkommende HHRz werden anhand der Helix die nicht durch einen Hairpin Loop geschlossen ist, in drei verschiedene Typen eingeteilt. Die katalytische Aktivität der HHRz ist abhängig von verschiedenen Faktoren, zum einen vom Vorhandensein von divalenten Metall-Ionen und zum anderen von Tertiärinteraktionen zwischen den Loops1 und 2 bzw. den Helices I und II. Basierend auf der Tatsache, dass Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 bzw. zwischen den Helices I und II für eine effiziente Faltung und schnelle Spaltungskinetiken verantwortlich sind, könnten für die HHRz kombinierte Sequenz- und Strukturbeschreibungen erstellt werden. Mit diesen ist es möglich gezielt Datenbanken nach genomisch codierten HHRz zu durchsuchen. So konnten in Zusammenarbeit mit Carsten Seehafer und dem von ihm entwickelten Programm RNAhit, welches auf Sequenz- und Strukturmotiven sowie auf thermodynamischen Faltungsparametern basiert, eine Vielzahl von Typ III HHRz in allen Bereichen des Lebens identifiziert werden. Jedoch kann durch diese Suchen nicht zwischen HHRz unterschieden werden, die nur den Musterbeschreibungen entsprechen und solchen die katalytisch funktionell sind. Somit sollte anhand von 19 ausgewählten primären HHRz Treffern, aus Xenopus tropicalis, Arabidopsis thaliana und Arabidopsis lyrata, die katalytische Aktivität in in vitro Spaltungsexperimenten untersucht und anhand der Ergebnisse die Filtereinstellungen bestätigt oder optimiert werden. Der ∆G-Wert ist ein Maß für die thermodynamische Stabilität einer Molekülstruktur und somit, neben der freien Faltung in ein HHRz, eines der wichtigsten Filterkriterien bei der Suche nach katalytisch aktiven HHRz. Alle ausgewählten primären Treffer zeigten einen ∆G0 37°C, free-Wert von ≤ -10 kcal/mol und unterschiedliche ∆∆G0-Werten. In in vitro Spaltungsanalysen in Anwesenheit von 2 mM MgCl2 konnten für acht der insgesamt 19 analysierten HHRz in Abhängigkeit von der Zeit eine autokatalytische Aktivität beobachtet werden. Dabei zeigten die HHRz Motive Xetr1, 2, 4, 5, 7 und 8 aus X. tropicalis, Arly3 aus A. lyrata und das als Positivkontrolle eingesetzte Ara1 Motiv die Spaltung des full length Transkripts in die beiden Spaltprodukte. In einem anschließenden Vergleich der Sequenzen, Sekundärstrukturen und thermodynamischen Parameter der spaltenden und nicht spaltenden HHRz, konnten die Filtereinstellungen zur Identifizierung katalytisch aktiver HHRz wie folgt angepasst werden: Der ∆∆G0-Wert sollte  0 sein, die freie Faltung sollte die typische HHRz Sekundärstruktur ausbilden und die Helix-Regionen I und II sollten keine Wobble-Basenpaarung (U-G oder G-U) aufweisen. Nach Anwendung des angepassten Analyseprogramms konnten für A. thaliana aus den anfänglich 988 Treffern lediglich die beiden schon bekannten katalytisch aktiven HHRz, Ara1 und Ara2, gefunden werden. Im Falle von A. lyrata konnte unter den 1490 gefundenen HHRz Motiven ein Treffer, mit einer Sequenzhomologie von 99% zu Ara1 aus A. thaliana, identifiziert werden und für X. tropicalis konnten aus der Großzahl der primären Treffer (4976) noch 6 katalytisch aktive HHRz herausgefiltert werden. Somit stellt sich heraus, dass nicht jedes den Musterbeschreibungen entsprechende HHRz Motiv katalytische Eigenschaften besitzt und dass es einer spezifischen Filtereinstellung zur Identifizierung von aktiven HHRz bedarf. Des Weiteren konnten die 6 neu identifizierten HHRz aus X. tropicalis auf genomischer DNA amplifiziert werden, wobei nicht für alle Motive eine 100%ige Übereinstimmung zu den in der Datenbank hinterlegten Sequenzen festgestellt werden konnte. Lediglich die beiden hochkonservierten Motive Xetr7 und 8 zeigten eine 100%ige Homologie und wurden in Abhängigkeit ihrer genomischen Umgebungssequenz in vitro auf ihre katalytische Aktivität geprüft. Dabei konnte entgegen aller Erwartungen festgestellt werden, dass in der Umgebungssequenz von Xetr7 und 8 zusätzliche katalytisch aktive HHRz vorhanden sind, die mit den zuvor beschriebenen Analyseprogramm RNAhit nicht gefunden werden konnten. Weiterhin konnte mittels einem S1 Nuklease Protektionassay die Expression dieser hochkonservierten Region in verschiedenen Geweben von X. tropicalis gezeigt werden. Die Ausbildung der katalytisch aktiven Form eines HHRz beruht auf tertiären Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 und es spielen die hochkonservierten Nukleotide der Core-Region eine entscheidende Rolle. So konnte in diesem Zusammenhang bereits in zahlreichen Studien gezeigt werden, dass diese tertiären Interaktionen die Aktivität natürlich vorkommender HHRz erhöhen und die Abhängigkeit der Magnesiumkonzentrationen auf einen in der Zelle vorhandenen physiologischen Wert senken. In diesem Zusammenhang konnten, neben den in vitro Spaltungsanalysen erstmals auch ein von Stephan Wiegand in Dictyostelium discoideum etabliertes ß-Gal Reportersystem zur in vivo Analyse der katalytischen Aktivität der HHRz Motive unter physiologischen Bedingungen genutzt werden. Somit wurden PolyC-Loop Mutanten von vier unterschiedlichen Typ III HHRz Wildtypsequenzen (Xetr2 und 5, PLMVd, Ara1) in vivo und in vitro analysiert. Dabei stellte sich heraus, dass die Ausbildung von tertiären Interaktionen zwischen den Loops1 und 2 über nicht Watson-Crick Basenpaare in den verschiedenen Organismen nicht denselben Einfluss auf die katalytische Aktivität haben. So wiesen alle PolyC-Loop1 Mutanten eine ähnliche Aktivität wie der WT auf, wogegen die PolyC-Loop2 Mutanten eine deutlich verringerte Aktivität zeigten. Dies deutet darauf hin, dass die Substitution der Loop2 Nukleotide zu Cytosinen die Interaktion mit Loop1 verringert, wodurch den WT Nukleotiden in Loop2 eine für die katalytische Aktivität entscheidende Rolle zukommt. Lediglich bei den PLMVd C-Loop Mutanten konnte im Spaltungsverhalten kein nennenswerter Unterschied im Vergleich zum WT festgestellt werden. Somit sprechen die Ergebnisse deutlich für die Ausbildung von individuellen tertiären Interaktionen zwischen den Loop1 und Loop2 Sequenzen bzw. den Helices I und II, wodurch die aktive Konformation des HHRz stabilisiert wird. Des Weiteren zeigt die Core-Region der HHRz eine hochkonservierte Sequenz bestehend aus 11 Nukleotiden, dabei ist die Spaltstelle so definiert, dass an Position 17 ein A, C oder U aber kein G vorhanden sein sollte. Im Falle eines G an dieser Position sollte es zu einer Basenpaarung mit dem gegenüberliegenden C an Position 3 kommen, somit sollte die Spaltstelle blockiert werden und keine aktive HHRz Konformation ausgebildet werden (Ruffner et al., 1990). Unter dieser Voraussetzung sollte die G17 Mutante zunächst als interner Größenstandard für das WT Motiv in der in vitro Transkription dienen. Jedoch zeigten diese in vitro Experimente eine katalytische Aktivtiät der G17 Mutanten, welche anschließend auch unter physiologischen Bedingungen in in vitro und in vivo Experimenten bestätigt werden konnten. Auffällig war, dass sie deutlich geringere Spaltungseffizienzen als die WT Sequenzen hatten, was mit der Ausbildung des G17C3 Basenpaares zusammenhängen könnte und dessen Einfluss auf die Bildung des für die katalytische Aktivität erforderlichen C3G8 Basenpaares. Anhand der erhaltenen Ergebnisse für die Funktionalität der G17 Mutante konnten diese Varianten auch im Genom von X. tropicalis, A. thaliana und S. mansoni identifiziert werden. Dabei zeigte sich, dass diese Motivvariationen der HHRz ähnlich häufig in den verschiedensten Organismen zu finden waren wie die C17 Motive und mit ihrer verringerten katalytischen Aktivität eine besondere Rolle in der Zelle spielen könnten. Mittels der Datenbanksuchen und experimentellen Analysen konnte ein Einblick über die Variabilität und Verbreitung der HHRz erhalten werden, wodurch jedoch die Suche nach der biologischen Funktion der HHRz in der Zelle deutlich erschwert wird.

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