Schneider, Sabine (2012)
Charakterisierung der Phosphorylierung von c-Abl an Threonin735 in Helicobacter pylori-infizierten Epithelzellen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein verbreitetes Humanpathogen, das die Magenschleimhaut von ca. 50% der Weltbevölkerung besiedelt. Ohne Eradikation des Bakteriums durch eine antimikrobielle Therapie persistiert es ein Leben lang. Eine Infektion mit H. pylori kann zu der Entstehung schwerwiegender Krankheiten wie Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren oder Magenkrebs führen. Die Entstehung solcher schwerwiegenden Krankheiten basiert auf dem Einfluss dieses Pathogens auf zelluläre Signalwege, die unter anderem eine vermehrte Zellmotilität, Zellproliferation oder eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Apoptose und Proliferation der infizierten Zellen bewirken. Studien haben eine Steigerung der Migration H. pylori-infizierter Zellen durch eine Aktivierung der nicht-Rezeptor-Tyrosinkinase c-Abl im Zytoplasma der Zellen gezeigt. C-Abl stellt ein zentrales Schalterprotein in der Regulierung von Apoptose und Zellmigration in Zellen dar, dessen Lokalisierung in der Zelle von entscheidender Bedeutung für seine Funktion ist. Eine Phosphorylierung von c-Abl an Threonin735 (c-AblT735) ermöglicht eine Bindung von c-Abl an dem zytoplasmatischen Bindeprotein 14-3-3 und verzögert bei einer Aktivierung der Tyrosin-Kinase dessen Translokation in den Zellkern und eine damit verbundene Induktion von Apoptose. In der hier vorgelegten Arbeit wurde der Einfluss von zytoplasmatischem c-Abl in H. pylori-infizierten gastralen Epithelzellen auf Apoptose und Zellmigration untersucht. Der Fokus lag auf dem Einfluss der Phosphorylierung von c-AblT735 auf diese H. pylori-induzierten Prozesse und der Identifizierung der c-AblT735-phosphorylierenden Threoninkinase in diesen Zellen. Eine H. pylori-induzierte Phosphorylierung von c-AblT735 wurde unter Verwendung eines anti-phospho-c-AblT735 Antikörpers im Western Blot in allen drei untersuchten epithelialen Zelllinien nachgewiesen. Die zelluläre Auswirkung in Bezug auf Apoptose, Zellviabilität und Zellmigration wurde in Zellen dokumentiert, die jeweils ein c-Abl-Wildtyp (c-Ablwt) Protein oder dessen phosphorylierungsresistente Mutante c-AblT735A über-exprimierten und mit H. pylori infiziert wurden. Laserskanmikroskopie zeigte, dass T735-phosphoryliertes c-Ablwt im Zytoplasma der H. pylori-infizierten Epithelzellen lokalisiert war, wohingegen die phosphorylierungsresistente c-AblT735A-Mutante vornehmlich im Zellkern nachgewiesen wurde. Eine FACS-Analyse von c-Ablwt- und c-AblT735A-exprimierenden Zellen wies nach H. pylori-Infektion deutlich mehr apoptotische Zellen in den c-AblT735A- als in den c-Ablwt-exprimierenden Zellen auf. Sechs Stunden nach Infektion der c-Ablwt-exprimierenden Zellen mit MOI 50 wiesen diese im Vergleich zu den kontrollinfizierten Zellen sogar 6% weniger apoptotische Zellen auf, wohingegen die c-AblT735A-exprimierenden Zellen 6% mehr apoptotische Zellen als deren Kontrolle aufwiesen. Eine H. pylori-Infektion der c-AblT735A-exprimierenden Zellen mit MOI 100 nach 24 Stunden, apoptotische Zellen c-Ablwt 26% c-AblT735A 45%, und MOI 10 nach 48 Stunden, apoptotische Zellen c-Ablwt 51% c-AblT735A 68%, zeigte den deutlichsten Unterschied in der Induktion von Apoptose zwischen c-Ablwt- und c-AblT735A-exprimierenden Zellen. Das Ergebnis des FACS Apoptose-Assays wurde anhand eines Zellviabilitäts-Assays bestätigt. In einem Zellmigrations-Assay wurde nach 24-stündiger H. pyolri-Infektion mit MOI 50 eine Erhöhung der Migration der c-Ablwt-exprimierenden Zellen um das 4,3fache im Vergleich zu den c-AblT735A-exprimierenden Zellen um das 2,5fache dokumentiert. Anhand der Apoptose-, Zellviabilitäts- und Zellmigrationsassays konnte erstmals eine antiapoptotische und promigratorische Funktion der H. pylori-induzierten T735-Phosphorylierung in infizierten Epithelzellen aufgezeigt werden. Ko-Immunpräzipitation von phosphoryliertem c-Abl mit dem zytoplasmatischen Bindeprotein 14-3-3 mit einem anti-c-Abl Antikörper und anschließender Detektion von 14-3-3 mit einem anti-14-3-3 Antikörper im Western Blot zeigte eine gesteigerte Interaktion beider Proteine nach Infektion gastraler Epithelzellen mit H. pylori. Auf bakterieller Ebene wurde eine Abhängigkeit der Phosphorylierung von dem Vorhandensein der cag-Pathogenitätsinsel (cagPAI), einem funktionellen T4SS und dem Adhäsin CagL mittels anti-phospho-c-AblT735 Antikörper im Western Blot nachgewiesen. Der Grad der induzierten Phosphorylierung war unabhängig von den bakteriellen Pathogenitätsfaktoren CagA und VacA. In vorangegangenen Studien war die zelluläre dual-spezifische Serin/Threonin-Thyrosin-Proteinkinase TTK als diejenige Kinase identifiziert worden, die c-Abl an T735 zu phosphorylieren vermag. Die Ergebnisse der in vitro Phosphorylierungsreaktion von c-Abl durch Proteinkinase C (PKC), der spezifische knock down von TTK und PKCs mittels siRNA und die Dokumentation der Aktivierung der PKC Isoformen α und β mittels spezifischer Antikörper gegen aktiviertes PKC α und β im Western Blot in dieser Arbeit deuten jedoch darauf hin, dass die H. pylori-induzierte Phosphorylierung auf einer gesteigerten Aktivität der Proteinkinase C Isoformen α und β der infizierten Zellen basiert. Aufgrund dieser Beobachtungen ist es naheliegend, dass eine Interaktion von bakteriellem CagL mit Integrinen der Wirtszelle zu einer Aktivierung der Serin/Threoninkinasen PKCα und PKCβ führt. Die daraus resultierende Phosphorylierung an c-AblT735 führt zu einer antiapoptotischen, prozellmigratorischen Reaktion der H. pylori-infizierten Zellen, basierend unter anderem auf einer Interaktion mit 14-3-3 und somit dem Zurückhalten von c-Abl im Zytoplasma der Zellen.

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