Yi, Dong (2012)
Enzymatic Properties and Directed Evolution of Transketolase and Chemoenzymatic Synthesis of neo-Sialoconjugates.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Transketolase (TK, EC 2.2.1.1) katalysiert den stereospezifischen Transfer einer C2- Ketoleinheit auf das Carbonylende einer Reihe von Aldehyden. Die Verwendung der TK zum Aufbau von Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen erhält wegen der hoch stereoselektiven Bildung eines (S)-konfigurierten, chiralen Zentrums unter gleichzeitiger Racematspaltung von (2R)-Hydroxyaldehyden vermehrte Beachtung. Insbesondere beim Einsatz von Hydroxypyruvat (HPA) als Donor führt die Freisetzung von CO2 zu einer irreversiblen Reaktion wobei das freigesetzte Bicarbonat den pH-Wert des Reaktionssystems erhöht. Aufbauend auf diesem Prinzip wurde, mit HPA als Donor und Phenolrot als empfindlichem pH Indikator, eine neue, kontinuierliche pH-basierte Assaymethode für das Hochdurchsatzscreening der TK entwickelt. Dieser generische Assay kann zuverlässig für die Colorimetrische Bestimmung der spezifischen Enzymaktivität und zur Messung kinetischer Konstanten benutzt werden. Mit dieser Methode wurden sowohl die kinetischen Konstanten und die Akzeptoraffinitäten der TK aus Escherichia coli (TKeco) und Saccharomyces cerevisiae (TKyst) als auch zweier TKeco-Mutanten, (TKD469E eco und TKH26Y eco), für einen detailierten Vergleich untereinander ermittelt. Die quantitativen Daten zeigen, dass das katalytische Potenzial von Wildtyp-TKeco und TKyst sehr ähnlich sind und nur eine geringe Variation aufweisen. Wildtyp-TK-Enzyme haben eine hohe Präferenz für α-hydroxylierte Akzeptoren, zusammen mit einer ausgeprägten Stereoselektivität gegenüber der (2R)-Konfiguration. Die Variante TKD469E eco zeigt signifikant höhere Aktivität gegenüber 2-deoxygenierten Aldehyden als das entsprechende Wildtyp Enzym. Die TK aus Geobacillus stearothermophilus (TKgst) ist ein neues Enzym, das kürzlich kloniert wurde und eine beeindruckende Thermostabilität aufweist. Ähnlich wie andere TKs zeigt es eine geringe Aktivität bei nicht α-hydroxylierten Aldehyden. Um diese Aktivität zu erhöhen wurden in einem ersten Versuch Sättigungsmutagenesebibliotheken der TKgst an den Positionen Leu382 und Asp470 erstellt. Leu382 and Asp470 sind die entsprechenden Aminosäurereste zur Bindung der Hydroxymethylen-Gruppe von α-hydroxylierten Aldehyden. Das Screening der Bibliothek lieferte mehrere positive Varianten, sowohl aus der einfach, als auch aus der doppelt mutierten Bibliothek. Als herausragende Mutante konnte die Variante Asp469Ile mit einer 17-, 13- und 8.6-fachen Aktivitätsverbesserung im Vergleich zum Wildtyp-Enzym gegenüber Propanal, Butanal and Methoxyethanal identifiziert werden. Ihre hohe Thermostabilität mit einer Tm von 74 °C bleibt erhalten. Sialinsäuren sind Kohlenhydrat-Derivate bestehend aus neun Kohlenstoffatomen die eine Carboxylaruppe besitzen. Sie kommen weit verbreitet frei oder konjungiert an Glycanen der Zelloberfläche von und erfüllen dort wichitge Funktionen in der Zellphysiologie. Deshalb ist es wichtig, Methoden für die Synthese spezifisch sialokonjugierter Epitope in vitro zu entwickeln, um die Forschung von Kohlenydrat-Protein-Interaktionen in physiologischen Prozessen zu ermöglichen. Sialinsäurereste werden von α/β-Galactosyl-α-2,3/2,6-Sialyltransferasen auf die terminale Galactoseeinheit von Oligosacchariden übertragen. Deshalb stellen diese nützliche Werkzeuge für die Synthese von Sialokonjugaten in vitro dar. Zu diesem Zweck wurden α-2,3- und 2,6-Sialyltransferasen aus Photobacterium phosphoreum (2,3SiaTpph) und entsprechend aus Photobacterium leiognathi JT-SHIZ-145 (2,6SiaTple) kloniert. Um die Substratspezifität dieser beiden SiaTs zu untersuchen, wurde zur Bestimmung der kinetischen Konstanten und der Substrattoleranz ein pH-basierter Assay etabliert, in dem Phenolrot als pH-Indikator in schwach gepuffertem Medium dient. Diese pH-Assay-Methode ist schnell, empfindlich und kontinuierlich und konnte zur Bestimmung der kinetischen Konstanten und der Substrattoleranz von 2,3SiaTpph und 2,6SiaTple herangezogen werden. Diese beiden SiaTs weisen eine deutlich unterschiedliche Akzeptorspezifität auf. Während die 2,3SiaTpph α- und β-Galactoside, Lactoside, Glc, Man und GalNAc gut akzeptieren kann, zeigt die 2,6SiaTple nur gegenüber β-Galactosiden und Lactosiden eine hohe Aktivität. Durch den Strukturabgleich zwischen 2,3SiaTpph and 2,6SiaTple wurde Trp347 als Ursache für die Blockade des aktiven Zentrums für α-Galactoside identifiziert. Um die Aktivität der 2,6SiaTple bezüglich α-Galactosiden zu verbessern wurden drei Mutagenesebibliotheken erstellt. Hierfür wurde die Hochdurchsatz-Screeningmethode mit Methyl-α-D-galactopyranosid als Akzeptor verwendet. Es konnte jedoch keine positive Variante identifiziert werden, was zeigt, dass Trp347 in der 2,6SiaTple offenbar nicht problemlos ersetzbar ist. Es ist zu vermuten, dass Trp347 zur Bindung zwischen Donor und Akzeptor beiträgt und die korrekte Akzeptor-Konformation für die Bildung von 2,6-sialisierten Produkten stabilisiert. Die CMP-Sialinsäure-Synthetase (CSS, E.C. 2.7.7.43) katalysiert die CMP-Aktivierung von Sialinsäuren unter Verwendung von CTP als Donor und Mg2+ als Cofaktor. Es konnte gezeigt werden, dass eine Reihe von Neu5Ac-Analogen mit einer sterisch auspruchsvollen Modifikation an der Acylamino-Gruppe von CSS aus Neisseria meningitidis (CSSnme) akzeptiert werden können, obwohl ihre korrespondierenden kcat/KM Werte viel niedriger sind als diejenigen des natürlichen Substrates Neu5Ac. Durch ein Alignment des aktiven Zentrums für die Akzeptorbindung der CSSnme wurden Phe192 und Phe193 als die entsprecheuden Reste für die Bindung der Acylaminogruppe in Neu5Ac identifiziert. Darauf aufbauend wurden vier Sättigungsmutagenesebibliotheken an den Positionen Phe192 und Phe193 konstruiert, um die Aktivität gegen Neu5Ac-OBz, Neu5Hex und Neu5PenN3 zu verbessern. Aus dem Screening mit der pH-basierten Hochdurchsatzmethode ergaben sich CSSnme-Phe192Cys/Phe193Tyr, CSSnme-Phe192Ser, und CSSnme-Phe192Ser/Phe193Tyr als die besten Kandidaten mit jeweils 14.1-, 4.6- und 4.0-facher Aktivitätssteigerung gegen Neu5Ac-OBz, Neu5Hex und Neu5PenN3. Um die verbesserte Aktivität zu validieren, wurden diese drei CSS-Varianten zusammen mit der 2,6SiaTple für eine präparative Synthese von neuen Neo-Sialokonjugaten verwendet. Die Ausbeuten der Endprodukte betrugen 50%, 64% bzw. 70%. Oligosacharide mit einer endständigen N-Acetyl-D-lactosamin Einheite (LacNAc) sind ein wichtiges natürliches Substrat der SiaTs. Die Synthese von LacNAc und seiner Derivate in vitro erweitert daher die Akzeptor Vielfalt für die Herstellung von Neo-Sialokonjugaten. Für diesen Zureck wurden die β-1,4-Galactosyltransferase aus Helicobacter pylori (GalThpy) und die UDP-Galactose-4-Epimerase aus E. Coli (GalEeco) kloniert und in einem E. coli-Expressionssystem exprimiert. Mit Hilfe dieser beiden rekombinanten Enzyme wurden freies LacNAc und LacNAc-D-T-P-Acr aus UDP-Glc als Donor sowie den entsprechenden Akzeptorsubstraten in isolierten Ausbeuten von 88%, 92% und 85% jeweils im 100 mg-Maßstab für weitere präparative Zwecke synthetisiert. Unter Verwendung der 2,3SiaTpph bzw. 2,6SiaTple sowie der neuen CSS-Varianten wurden die Neo-2,3- und 2,6-Sialokonjugate in einer Eintopf-Reaktion mit zwei Enzymen synthetisiert. Sechs typische Sialinsäuren (Neu5Ac, Neu5Gc, Kdn, epi-Kdn, Neu5Ac-9-N3 und Neu5NPhAc) mit Modifikationen an C5 und C9 wurden als Donoren an fluoreszente Lactose (Lac-D-T-P-Acr) und N-Acetyl-D-lactosamin (LacNAc-D-T-P-Acr) mit α-2,3- and α-2,6-Konfiguration gekuppelt. Die 2,3SiaTpph und 2,6SiaTple zeigen sehr ähnliche Donorspezifitäten gegen über diesen sechs Sialinsäuren. Beide akzeptieren Neu5Ac, Neu5Gc, Kdn und Neu5Ac-9-N3 gut, reagieren jedoch mit dem sterisch auspruchsvollen Neu5NPhAc schlechter. Darüber hinaus kann die 2,6SiaTple das epi-Kdn besser als die 2,3SiaTpph akzeptieren. Kürzlich wurde eine neue potentielle Sialyltransferase aus Shewanella piezotolerans (SiaTspi) beruhend auf der genomischen DNA-Sequenz von S. piezotolerans beschrieben. Über eine Klonierung, Expression und einen Aktivitätstest der SiaTspi liegen jedoch noch keine Berichte vor. Deshalb wurde das künstliche Gen im Rahmen dieser Arbeit kloniert, modifiziert und optimal im E. coli und Yarrowia-Expressionssystem exprimiert. Der Sequenz-BLAST und die strukturelle Übereinstimmung mit anderen 2,3SiaT-Sequenzen innerhalb der CAZy-Familie GT80 ließen eine funktionelle upstream-Sequenz erkennen. Die Deletion eines Loops mit 12 Aminosäurenresten verbesserte die Identifizierung der 2,3-SiaT-Aktivität durch eine Reaktion mit fluoreszenzmarkiertem Akzeptor, insbesondere bei Koexpression mit Chaperonen. Die geringe Expression an löslichem Protein sowohl im E. coli-, als auch im Y. lipolytica-Expressionssystem vereitelte jedoch eine weitergehende Charakterisieng des Enzymes.

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