Schuster, Christina (2012)
Biologische Bekämpfung des Falschen Mehltaus an der Gurke (Pseudoperonospora cubensis), Wirkung und Wirkweise von Aneurinibacillus migulanus und Federmohn-Extrakt.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Mikroorganismen und aus Pflanzen gewonnene Naturstoffe können zur Bekämpfung von Phytopathogenen genutzt werden. In der Literatur lassen sich zahlreiche Beispiele dafür finden. Ziel der Arbeit war es, die Bakterienkultur aus Aneurinibacillus migulanus und einen Pflanzenextrakt aus Federmohn (Macleaya cordata) auf ihre Wirksamkeit gegen den Falschen Mehltau an Gurke verursacht durch Pseudoperonospora cubensis und die bestehenden Wirkmechanismen hin zu untersuchen. Zusätzlich sollten weitere Phytopathogene identifiziert werden, gegen die der Federmohnextrakt wirksam ist. Für die Bakterienkultur wurde die Möglichkeit der Kultivierung auf festem Medium überprüft. Es wurden außerdem vergleichende Untersuchungen verschiedener Phänotypen von A. migulanus durchgeführt.

Der Extrakt aus M. cordata wurde von der Firma Phytobiotics GmbH in einem speziellen Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren enthielt auch die Aufkonzentrierung der wirksamen Substanz (Sanguinarin) auf durchschnittlich 60 %. Daher waren nur sehr geringe Mengen nötig, um einen hohen Wirkungsgrad gegen P. cubensis an Gurkenpflanzen im Biotest (Klimaraum) zu erzielen. Schon 40 – 50 µg/ml Extrakt waren ausreichend, um den Befall bei protektiver Anwendung um 90 % zu reduzieren. Mit der Flüssigkultur von A. migulanus ließ sich in dreifacher Verdünnung eine sehr gute protektive Wirkung von ca. 90 % erreichen. Diese Verdünnung entsprach ca. 200 µg/ml Gramicidin S, welches als Metabolit vom Bakterium gebildet wird und dem die hauptsächliche Wirkung zugeschrieben wird. Neben diesem Metaboliten gibt A. migulanus auch eine als Bionetzmittel wirkende Substanz in das Kulturmedium ab. Sie bewirkt, dass die Oberflächenspannung von Wasser gesenkt wird und die Pflanzen nach dem Benetzen schneller abtrocknen. Gurkenpflanzen, die mit der Kultur des A. migulanus E1-Stammes (bildet kein Gramicidin S) behandelt wurden, waren im Gegensatz zu den wasserbehandelten Pflanzen schon nach 30 min vollständig abgetrocknet. Dieser Abtrocknungseffekt bewirkte eine Verringerung des Befalls um ca. 71 % gegenüber der Kontrolle mit der selben Abtrocknungsdauer. Die Mischung des Extraktes aus M. cordata (50 µg/ml) und der Kulturbrühe von A. migulanus (1:5) führte zu einer nicht signifikanten Verbesserung der Wirkung der Mischungspartner. Von den Hauptwirkstoffen beider Präparate (Sanguinarin und Gramicidin S) sind zahlreiche direkte Wirkungen gegen Bakterien und Pilze beschrieben worden. In den eigenen Versuchen verringerten der Pflanzenextrakt sowie die Bakterienkultur den Schlupf und das Überleben der Zoosporen von P. infestans unter in vitro Bedingungen. In einem entsprechenden Versuch auf Blattscheiben bildeten geschlüpfte und enzystierte Zoosporen von P. cubensis nur wenige oder keine Keimschläuche aus. Auch das Myzelwachstum des auf Medium kultivierbaren Oomyceten P. infestans wurde durch Gramicidin S und den Pflanzenextrakt gehemmt. Neben der direkten Wirkung auf das Pathogen kann ein Präparat auch durch eine Induktion einer Resistenz in der Pflanze wirken. Mit Untersuchungen dazu wurde begonnen. Durch DAB-Färbung wurde eine erhöhte Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies nachgewiesen, die vor allem nach Behandlung von ausgestanzten Blattscheiben mit dem Überstand der Kultur von A. migulanus wie auch mit dem Pflanzenextrakt beobachtet wurde. Wurden die Blattscheiben mit gewaschenen Bakterienzellen oder dem Metaboliten Gramicidin S behandelt, trat keine starke Reaktion auf. Die Expression von an Stressantworten beteiligten Enzymen mittels quantitativer Real-Time PCR zeigte eine starke Steigerung von Peroxidase kodierenden Genen (POD). Bei Pathogenesis Related Protein-1 kodierenden Genen (PR-1), wurde nur ein leichter Anstieg verglichen mit der Kontrolle beobachtet. Obwohl die Ergebnisse die direkte Wirkung der Präparate eindeutig belegen, kann die Resistenzinduktion nicht völlig ausgeschlossen werden. Hierzu sind weitere Untersuchungen notwendig.

Durch mehrfache Kultivierung der Bakterienkultur in flüssigem TSB-Medium kam es zur Aufspaltung in verschiedene Phänotypen. Es wurde ein Stamm A. migulanus weiß isoliert, der dem Wildtyp in Kolonieform, Sporenbildung und Metabolitenproduktion sehr ähnlich war. Ein weiterer Stamm mit untypischer Morphologie fiel auf, dessen Kolonien durchscheinend waren. Er bildete insgesamt weniger Zellen und keine Sporen, war jedoch in der Lage Gramicidin S zu produzieren. Durch phylogenetische Analyse der 16S rRNA kodierenden Gene wurden beide Stämme dem A. migulanus-Typenstamm (DSM 2895T) zugeordnet, was durch Sequenzähnlichkeiten von 99,9 – 99,7 % in der p-Abstandsmatrix unterstützt wurde.

Für die Anwendung in der Praxis werden große Mengen der Kulturbrühe von A. migulanus benötigt. Vorangegangene Untersuchungen zur Kultivierung ergaben jedoch, dass es bisher schwierig ist, das Bakterium im Flüssigfermenter (7 L) zu fermentieren. Das Problem bestand darin, dass A. migulanus hier zwar Sporen bildete, aber nur sehr wenig Gramicidin S produzierte. In eigenen Versuchen war die Kultivierung auf festem Medium dagegen problemlos möglich und es konnten vergleichbare Gramicidin S-Ausbeuten wie bei der Kultivierung im 1 L-Erlenmeyerkolben (200 ml TSB) erzielt werden. Der Nachteil dieser Kultivierungsmethode bestand jedoch darin, dass kein Bionetzmittel „geerntet“ werden konnte, da dieses entweder nicht gebildet wurde oder in das Nährmedium hinein diffundierte. Die Wirkung dieser Präparate beruht demgemäß ausschließlich auf dem produzierten Metaboliten.

Der Extrakt aus M. cordata wird in Deutschland als Zusatzstoff für Tierfutter verkauft (Phytobiotics GmbH) und es ist wenig über das Wirkspektrum gegen Phytopathogene bekannt. Neben der sehr guten Wirkung gegen Falschen Mehltau-Pilze konnte keine Wirkung gegen den Erreger des Echten Gurkenmehltaus (Podosphaera xanthii) gefunden werden. Es zeigte sich jedoch, dass in hohen Konzentrationen von 1000 µg/ml eine Wirkung gegen Möhrenschwärze (Alternaria dauci und A. radicina) an Möhrensaatgut besteht. Daher ist der Einsatz als Saatgutbeizmittel denkbar. In in vitro Versuchen auf Nährmedium wurden die Pilze Botrytis cinerea, Fusarium graminearum und Phytophthora infestans durch Konzentrationen von 20 - 50 µg/ ml im Wachstum gehemmt. Die Ergebnisse aus diesen Versuchen bieten Anhaltspunkte für das Wirkspektrum des Extraktes aus M. cordata. Versuche an ganzen Pflanzen unter kontrollierten und unter Praxisbedingungen sollten folgen, um diese Ergebnisse zu verifizieren.

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