Sortierung von Membranproteinen: Einfluss N-terminaler Signale am Beispiel kleiner viraler Kalium-Kanäle

Chappuis, Charlotte von (2013)
Sortierung von Membranproteinen: Einfluss N-terminaler Signale am Beispiel kleiner viraler Kalium-Kanäle.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3329/

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die Sortierung von Membranproteinen im eukaryotischen Zelltyp ist maßgeblich abhängig von Protein-codierten Signalsequenzen. Um den Mechanismus der Signalsequenz-abhängigen Sortierung zu sehr unterschiedlichen Zielen wie der Plasmamembran und den Mitochondrien besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit die beiden viralen Kalium-Kanäle PBCV1-Kcv und Kesv als Sortierungswerkzeug eingesetzt. Beide Proteine sind strukturell gekennzeichnet durch zwei Transmembrandomänen pro Untereinheit, die in einer tetrameren Anordnung ein funktionelles Protein aufbauen. PBCV1-Kcv aus dem Paramecium Bursaria Chlorella Virus 1und Kesv aus dem Ectocarpus Siliculosus Virus zeigen trotz eines hohen Grades an Homologie bezüglich Stuktur und Funktion im heterologen Expressionssystem HEK293 eine unterschiedliche zelluläre Sortierung. Während PBCV1-Kcv in der Plasmamembran lokalisiert werden konnte, wurde Kesv in der inneren mitochondrialen Membran lokalisiert (Balss et al. 2008). Um diese unterschiedliche Sortierung besser zu verstehen, wurden Lokalisationsstudien mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten PBCV1-Kcv/Kesv-Chimären durchgeführt, mit denen folgende Erkenntnisse gewonnen werden konnten: Die post-translationale Sortierung von Kesv in die innere mitochondriale Membran ist sehr empfindlich und toleriert Mutationen nur in sehr kleinem Umfang. Daher wird fast die gesamte Kesv-Sequenz benötigt, um das Protein zielsicher in die Mitochondrien zu transportieren. Dagegen ist die post-translationale Sortierung von PBCV1-Kcv in die Plasmamembran über den sekretorischen Weg wenig störanfällig. Die Sortierung von PBCV1-Kcv wird stark geleitet durch die Signalsequenz M26-D68 Kcv, welche im letzten Drittel der ersten Transmembrandomäne lokalisiert werden konnte. Wird diese Signalsequenz von PBCV1-Kcv an gleicher Position in Kesv eingesetzt, erfolgt eine Sortierung dieser PBCV1-Kcv/Kesv Chimäre (hier Chim3.3 genannt) in die Plasmamembran. Scheinbar können sämtliche noch vorhandene mitochondriale Sortierungssignale, die durch die flankierenden Kesv-Sequenzabschnitte codiert werden das starke Sortierungssignal von PBCV1-Kcv in seiner Funktion nicht beeinflussen. Wird diese starke Signalsequenz von PBCV1-Kcv in einem schrittweisen Aminosäuren-Austausch gegen die Sequenz von Kesv ersetzt kann nach einem Austausch der ersten drei Aminosäuren wieder eine mitochondriale Sortierung erzielt werden. Der Wechsel in der Sortierung kann deshalb auf einen Sequenzabschnitt von 3 Aminosäuren eingegrenzt werden. Chim3.3 (M1-L49Kesv+M26-D68Kcv+L92-K124Kesv) wird noch in den sekretorischen Weg sortiert. Chim3.4 (M1-V50Kesv+I27-D68Kcv+L92-K124Kesv) zeigt keine eigenständige Sortierung und Chim4 (M1-V51Kesv+Y28-D68Kcv+L92-K124Kesv) kann wieder in den Mitochondrien lokalisiert werden. Die noch fragile mitochondriale Sortierung von Chim4 sowie die mitochondriale Sortierung von Kesv-wt können in einer Ko-Expression mit einem mitochondrialen Referenzprotein COXVIII::mKate2 sichtbar stabilisiert werden. Ein bisher unbekanntes Sortierungs-Phänomem kann mit der Sortierung von Chim3.4 beschrieben werden: Wie schon erwähnt verbleibt das Kanal Protein in alleiniger heterologer Expression unsortiert im Cytosol. Jedoch in Anwesenheit des Fluoreszenzproteins mKate2 zeigt die Chimäre eine Ko-Sortierung, dem Fluoreszenzprotein mKate2 folgend. Bei einer Fusion von mKate2 mit einer Kompartment-spezifischen Signalsequenz erfolgt eine gerichtete Sortierung von mKate2 in die Mitochondrien oder in das ER, der sich die Chimäre 3.4 anschließt. Somit kann die Sortierung des Proteins beliebig durch die Protein-Protein-Interaktion zwischen Chim3.4 und mKate2 gesteuert werden. Auf der Basis dieser Daten kann spekuliert werden, dass auch kleine zelluläre Proteine ohne eigene Sortierungssequenz mittels anderer Proteine in ein definiertes Kompartiment sortiert werden können.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2013

Autor(en):

Chappuis, Charlotte von

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

Sortierung von Membranproteinen: Einfluss N-terminaler Signale am Beispiel kleiner viraler Kalium-Kanäle

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Bertl, Prof. Dr. Adam

Publikationsjahr:

Februar 2013

Ort:

Darmstadt

Datum der mündlichen Prüfung:

8 Februar 2013

URL / URN:

http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3329/

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

The sorting of membrane proteins depends on a protein coded signal sequence. For a better understanding of such signal sequence depending sorting of proteins into different compartments, we use here the two viral potassium channels PBCV1-Kcv and Kesv as experimental tools. Both proteins are composed of two transmembrane domains per subunit, which form a functional protein in a tetrameric arrangement. Despite a high degree of similarities regarding the primary structure PBCV1-Kcv from Paramecium Bursaria Chlorella Virus 1 and Kesv from Ectocarpus Siliculosus Virus are sorted in heterologous expression system into different cell compartments. While PBCV1-Kcv can be localised in the plasma membrane, Kesv can be found in the inner mitochondrial membrane. To investigate the mechanism of differential sorting I performed localisation studies with the help of fluorescent labelled PBCV1-Kcv/Kesv chimaeras. The results of these experiments provide the following conclusions: The post-translational sorting of Kesv into the inner mitochondrial membrane is very sensitive and tolerates mutations only on a small scale. Therefore an unerring sorting into the mitochondria requires nearly the entire Kesv sequence. The post-translational sorting of PBCV1-Kcv into the plasma membrane via the secretory pathway is more robust. It strongly dependents on a signal sequence, which can be localised in the last third of the first transmembrane domain. Upon inserting this signal sequence into the respective position of Kesv, a change of sorting could be recognised. The corresponding PBCV1-Kcv/Kesv chimaera, called Chim3.3, is no longer sorted to the mitochondria but into the plasma membrane. This suggests all mitochondrial sorting signals, which are coded by the flanking Kesv sequence segments, are unable to override of the strong PBCV1-Kcv sorting signal. When I replaced this critical signal sequence one by one with the sequence of Kesv, it occurred that a substitution of the first three amino acids still resulted in a mitochondrial sorting again. Therefore, the change in sorting is within a region of only 3 amino acids. A test of the relevant chimaeras indeed reveals that Chim3.3 (M1-L49Kesv+M26-D68Kcv+L92-K124Kesv) is still sorted into the secretory pathway. Chim3.4 (M1-V50Kesv+I27-D68Kcv+L92-K124Kesv) presents no autonomous sorting and is distributed throughout the cell. Chim4 (M1-V51Kesv+Y28-D68Kcv+L92-K124Kesv) can be localised in the mitochondria. In a co-expression the fragile sorting of Chim4 as well as Kesv-wt into the mitochondria can be stabilised significantly by the presence of the mitochondrial marker protein COXVIII::mKate2. This so far unknown sorting phenomenon in which a protein assists another protein in sorting can be further substantiated for the targeting of Chim3.4: The aforementioned global distribution of Chim3.4 can be affect by a co-expression with the fluorescent protein mKate2. In the presence of mKate2 the channel protein shows a distinct co-sorting along with the sorting of mKate2. If mKate2 is fused to an organelle-specific sorting signal sequence, the fusion protein exhibits a directed sorting into the ER or the mitochondria. In that case Chim3.4 follows the sorting of the reference protein. The results of these experiments suggest that the sorting of Chim3.4 could be navigated by a protein-protein-interaction between the channel chimaera and mKate2. Based on the data we can speculate that also small cellular proteins without a specific sorting signal might be sorted into different compartments with the help of other proteins.

Englisch

URN:

urn:nbn:de:tuda-tuprints-33291

Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC):

500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie

Fachbereich(e)/-gebiet(e):

10 Fachbereich Biologie
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10 Fachbereich Biologie > Plant Membrane Biophyscis (am 20.12.23 umbenannt in Biologie der Algen und Protozoen)

Hinterlegungsdatum:

18 Mär 2013 16:26

Letzte Änderung:

15 Feb 2016 15:28

PPN: