| Kurzbeschreibung (Abstract): |
Der zentrale chemische Baustein der vorliegenden kumulativen Dissertation ist der 1,2,3-Triazol und dessen unterschiedliche Anwendungsmöglichkeiten in der Peptidchemie. Die hier präsentierten Studien können grob in zwei Teilgebiete eingeordnet werden: Gerüstmolekül-basierte Multimerisierung peptidischer Liganden durch Kupfer(I)-katalysierte Azid-Alkin Cycloaddition (CuAAC) und der Einsatz von 1,2,3-Triazolen als nichtnatürliche Struktur¬bausteine von Peptidomimetika. Der zweite Themenkomplex umfasst sowohl den biomimetischen Ersatz von Peptidrückgratelementen als auch die Substitution von makrozyklischen und linearen Seitenkettenmotiven. Hierfür kam zusätzlich zu der genannten CuAAC-Chemie auch eine Ruthenium(II)-katalysierte Variante (RuAAC) zum Einsatz. Die genannten synthetischen Methoden wurden erfolgreich für die Synthese verschiedener Triazol-haltiger peptidischer Substanzen angewendet und hinsichtlich der Durchführung in Lösung vor allem aber auch an der festen Phase vorangebracht.
Experimente zur Konstruktion wohldefinierter multivalenter Biokonjugate wurden mit fünf unterschiedlichen Peptidliganden und zwei regioselektiv addressierbaren funktionalisierten Platformmolekülen so genannten RAFT (regioselectively addressable functionalized template) durchgeführt. Die CuAAC-Kupplung gelang mit stöchiometrischer Konversion der Edukte zu den gewünschten verzweigten Peptidoligomeren und lieferte moderate bis gute Ausbeuten. Eines der synthetisierten Konstrukte beinhaltete vier Kopien einer „RGD“ Sequenz und zusätzlich einen Fluoreszenzmarker. Die genannten bioaktiven Peptidliganden können den GPIIb/IIIa Rezeptor binden und dadurch die Aggregation von Bltuplättchen inhibieren. Somit könnte dieses Gerüstmolekül-basierte multivalente Konstrukt für Fluoreszenzmikroskopie von GPIIb/IIIa-exprimierenden Zellen geeignet sein. Allerdings wurden keine detaillierten biologischen Untersuchungen mit diesem Biokonjugat durchgeführt, da ohnehin nur mit einem sehr geringen therapeutischen bzw. diagnostischen Nutzen zu rechnen ist. Desweiteren bleibt anzumerken, dass bis zum heutigen Zeitpunkt fortschrittlichere Biokonjuga¬tionsmethoden entwickelt worden sind, die nicht der Übergangsmetallkatalyse bedürfen. Dennoch stellt die beschriebene Studie eine Blaupause für die erfolgreiche Synthese heteromultivalenter Peptidkonjugate dar. Die berichtete Methode wird unter anderem weiterhin in der Arbeitsgruppe von Prof. Kolmar in verschiedenen Projekten zum Aufbau Gerüstmolekül-basierter Konstrukte mit anderen Peptidliganden verwendet, die therapeutisches oder diagnostisches Potential besitzen.
Eine weitere sehr vielversprechende Anwendung von 1,2,3-Triazolen beruht auf den besonderen physikochemischen Eigenschaften dieser stickstoffhaltigen aromatischen Heterozyklen. Sie können in Wasserstoffbrückenbindungen sowohl als Akzeptoren als auch Donatoren wirken, sind polar und besitzen eine gute Wasserlöslichkeit. Diese Faktoren und die Möglichkeit, selektiv 1,4- oder 1,5-disubstituierte 1,2,3-Triazole durch die Wahl des Übergangsmetallkatalysators der verwendeten Azid-Alkin Zykloaddition auszubauen, machen diese Baueinheit zu einem geeigneten nichtnatürlichen Ersatz von Amidbindungen. Es ist somit möglich, das Peptidrückgrat durch ein Hydrolyse-resistentes Biomimetikum zu ersetzen und darüber hinaus entweder in der trans- oder der cis-Konformation einzufrieren. Dieses Konzept wurde für das Design und die Synthese von peptidomimetischen Varianten des monozyklischen sunflower trypsin inhibitor-1 (SFTI-1[1,14]) herangezogen. Zu diesem Zweck wurde eine Strategie verwendet, welche Mikrowellen-unterstützte Fmoc-basierte Peptidfestphasensynthese (Fmoc-SPPS) mit CuAAC- oder RuAAC-Kupplungen an der festen Phase kombinierte. Die gewünschten Verbindungen konnten so in ausreichenden Mengen synthetisiert werden, um damit sowohl strukturelle Untersuchungen als auch in vitro Inhibitionstests durchzuführen. Die gelösten Kristallstrukturen von Trypsin-Inhibitor-Komplexen durch Röntgenbeugungsexperimente beweisen die erfolgreiche Synthese der funktionalen Peptidomimetika mit nichtnatürlichen Rückgratelementen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass mit diesem Ansatz auch die der nativen Struktur entgegenstehenden Amidkonformationen erzwungen werden können. Somit kann zum Beispiel an einer ausgewählten Stelle in der Aminosäurensequenz ein cis-Mimetikum installiert werden. Dieses ist insofern bemerkenswert, als cis-Peptidbindungen sehr selten in der Natur zu finden sind und meist nur vor Prolinresten auftreten. Diese Technik ermöglicht es demnach, neue peptidische Strukturen zu erzeugen, die mit dem kanonischen Repertoire nicht erreichbar wären. Wie erwartet führte das „Einfrieren“ einer dem natürlichen Rückgrat gegensätzlichen Amidkonformation beim SFTI-1 zu einer signifikant verminderten Bioaktivität. Schließlich gibt einem diese Methode die Möglichkeit an die Hand, bestimmte Peptidsegmente in einem Molekül gegen enzymatische Degradation zu schützen, was zu einer verbesserten in vivo Stabilität führen sollte.
Zwei weitere Studien hatten zum Inhalt, den Effekt von 1,2,3-Triazol-basierten Disulfidaustauschen auf die Bioaktivität von SFTI-1[1,14] zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden vier Seitenkettenmakrozyklisierungsmotive unterschiedlicher Länge und Form anstatt des natürlichen Cystins mittels kommerziell erhältlicher Bausteine installiert. Wieder kam einer Kombination aus Fmoc-SPPS und CuAAC oder RuACC an der festen Phase zum Einsatz. Die intramolekulare Reaktion ergab die gewünschten Triazole-verbrückten peptidomime¬tischen Verbindungen mit einem 1,4- oder einem 1,5-Disubstitutionsmuster. Die reinen Produkte wurden sowohl mittels Infrarot- und 2D-Kernresonanzspektroskopie als auch durch Massenspektrometrie (Elektrospray-Ionisation) charakterisiert. In vitro Inhibitionsunter¬suchungen zeigten, dass die Substitutionsart des Makrozyklisierungsmotivs einen dramatischen Einfluss auf die Bioaktivität hatte. Interessanterweise waren die Varianten mit einem 1,5-Muster potente Trypsininhibitoren und besaßen Substrat-unabhängige Inhibitionskonstanten Ki im einstellig nanomolaren bis subnanomolaren Bereich. Die 1,4-Gegenstücke hingegen zeigten eine signifikant verminderte Bioaktivität im Vergleich zum Wildtyp. Die Länge der verbrückenden Einheit zwischen dem Peptidrückgrat und dem Triazolebaustein hatte einen nicht so entscheidenden Einfluss. Diese in vitro-Ergenisse wurden durch molekulare Modellierung bestätigt, da in diesen in silico Experimenten eine bessere Übereinstimmung mit der Struktur des nativen Peptids für das RuAAC-Produkt beobachtet wurde. Somit wird die Verwendung von 1,5-disubstituierten 1,2,3-Triazolen als Disulfidbrückenersatz empfohlen. Allerdings sollte die geeignete Länge des Makrozyklisier¬ungsmotivs für jeden biologischen Kontext neu evaluiert werden.
Sowohl die vier SFTI-1-Derivate mit „Triazolbrücken“ als auch die beiden nativen mono- und bizyklischen Varianten wurden auf ihre Aktivität gegen die pharmazeutisch relevante Protease Matriptase getestet. Überraschenderweise wurde für alle sechs genannten Peptide eine dramatisch schlechtere Affinität als gegen Trypsin gemessen. Diese Beobachtung war unerwartet, da ein negatives elektrostatisches Oberflächenpotential am aktiven Zentrum von Matriptase Anlass für ausgeprägte attraktive Wechselwirkungen zwischen dem positiv geladenen SFTI-1-Gerüst und dem Enzym geben sollte. Um dieses kontraintuitive Ergebnis weiter zu untersuchen, wurde ein in silico Experiment mit Hilfe der Software YASARA structure und einem angepassten AMBER-basierten Kraftfeld in zwei Schritten durchgeführt. Zuerst, wurde eine Molekulardynamik Simulation durchgeführt. Danach wurden 100 Einzelstrukturen aus den erhaltenen Trajektorien für ein lokales Docking Experiment extrahiert. Durch den zugrundeliegenden AUTODOCK-Algorithmus konnten so die freien Bindungsenergien für alle Inhibitor-Enzym-Komplexe berechnet werden. In der Tat deuteten die in silico Affinitäten auf eine stärkere Interaktion zwischen dem SFTI-1-Gerüst und Matriptase im Vergleich zur Bindung an Trypsin hin. Allerdings wurde im Vergleich zu Trypsin eine erheblich reduzierte Rate, die obligatorische canonische Orientierung im aktiven Zentrum des Enzyms zu treffen, bei den Docking Experimenten gegen Matriptase ermittelt. Eine Normalisierung der berechneten freien Bindungsenergien mit Hilfe dieses Hitfaktors gab die tatsächlich gemessenen Affinitäten aus den in vitro Assays relativ gut wieder. Eine anschließende Strukturanalyse der simulierten Trajektorien und die Berechnung der Wurzel der mittleren quadratischen Abweichung (root-mean-square deviation, RMSD) einzelner Segmente der jeweiligen SFTI-1-Varianten gaben Anlass zu der Vermutung, dass negative entropische Beiträge, die ihren Ursprung in den terminalen Regionen der Peptide haben, die generell reduzierte Bioaktivität gegen Matriptase verursachen.
Die Ergebnisse der in silico Untersuchungen lieferten wertvolle Hinweise für mögliche Strategien zur Optimierung des Inhibitors gegen die pharmazeutisch relevante Serinprotease, welche in einer weiteren Studie untersucht wurden. Es wurde beobachtet, dass die offenkettige Variante von SFTI-1 (SFTI-1[1,14]) eine leichte Präferenz in ihrer Anti-Matriptase-Wirkung gegen über dem bizyklischen Wildtyp zeigte. Somit war dieses monozyklische Peptid ein geeigneter Startpunkt für die weiteren Versuche. Struktur-geleitete Überlegungen führten zu der Identifikation von drei Positionen innerhalb der Aminosäuresequenz, die potentiell für inkrementelle verteilhafte Modifikationen geeignet waren. Zwei dieser Reste wurden jeweils mit Azid-funktionalisierten nichtnatürlichen Baueinheiten ausgestattet, um eine divergente Synthese mittels eines kombinatorischen Ansatzes zu ermöglichen. Zusätzlich wurden auch Substitutionen mit ausgewählten kanonischen Aminosäuren durchgeführt. Zusammen ermöglichte dies den raschen Aufbau einer kleinen Molekülbibliothek mit 22 Peptiden, die sich durch jeweils eine einzelne andere Seitenkettenmodifikation unterschieden. Matriptaseinhibitionstests wiesen auf mehrere vorteilhafte Seitenkettenaustausche hin. Diejenigen Modifikationen mit den ausgeprägtesten Verbesserungen wurden in einer Verbindung vereint, welche eine Ki im einstellig nanomolaren Bereich besaß. Dieses Peptid wurde SFTI-1-derived matriptase inhibitor-1 (SDMI-1) genannt und beinhaltete ausschließlich Standardaminosäuren. Dennoch wurden auch signifikante Affinitätsverbesserungen für einzelne Triazol-haltige Verbindungen gegen Matriptase beobachtet. Dies zeigte die Nützlichkeit dieses Ansatzes einer „Click-Bibliothek“ für die rasche Sondierung diverser Seitenkettenfunktionalitäten hinsichtlich bestimmter gewünschter Eigenschaften.
Wie bereits erwähnt könnte ein möglicher nachteilbehafteter entropischer Beitrag durch die Sekundärschleife von SFTI-1 die Bindung an Matriptase beeinflusst haben. Deshalb wurden die zwei C-terminalen Reste von SDMI-1 in einer weiteren Variante trunkiert. Dieses Dodecapeptid wurde SDMI-2 genannt und besaß eine vergleichbare Aktivität wie SDMI-1. Darüber hinaus wurde ein verbessertes Selektivitätsprofil für das kürzere Peptid festgestellt, da es eine sechsfach schlechtere Aktivität gegen Trypsin als gegen Matriptase zeigte. Die entwickelten Verbindungen könnten wertvolle Peptidliganden für weitere Biokonjugationseperimente darstellen und werden derzeit auf eine mögliche Patentanmeldung geprüft. So zum Beispiel würde die direkte Ankopplung von Radionukliden, welche für Positronenemissions- oder Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (positron emission tomography PET, single-photon emission computed tomography SPECT) geeignet sind, evtl. eine Anwendung als diagnostische Werkzeuge für in vivo Bildgebung ermöglichen. Desweiteren ist das Potential für weitere Affinitäts- und Selektivitätsverbesserungen in Bezug auf Matriptase oder auch andere Proteasen von pharmazeutischer Relevanz noch nicht erschöpft.
Die in dieser kumulativen Dissertation vorgestellten und durch Fachleute begutachteten Artikel tragen dazu bei einen vielseitigen Werkzeugkasten für das Design und die Synthese von peptidomimetischen Verbindungen mit Hilfe von disubstituierten 1,2,3-Triazolen aufzubauen. Die vorgestellten Ergebnisse sind von Interesse für die biomolekulare Chemie im Allgemeinen und die Peptidchemie im Speziellen sein. |
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The studies presented in the cumulative section of this thesis illustrate a variety of applications of disubstituted 1,2,3-triazoles for biomolecular chemistry in general and peptide modification in particular. Taken together, these peer-reviewed reports provide a toolbox for the design and synthesis of peptidomimetic compounds. CuAAC and RuAAC methodologies have been established and advanced with respect to feasible conduction of regioselective azide-alkyne cycloadditions in solution as well as on the solid support. In combination with relevant publications by other working groups addressed in the introduction, a detailed knowledge of the scope and limitations of 1,2,3-triazoles and general AAC techniques suitable for peptide modification has been gathered. The described studies can be divided into two main sections: Scaffold-based multimerization of peptide ligands and 1,2,3-triazoles as non-natural structural elements of peptides. The latter topic comprises the design and synthesis of biomimetic backbone segments as well as macrocyclic or linear side-chain motifs.
Bioconjugation experiments towards well-defined multivalent architectures were conducted with five different azide-bearing ligands and two tetra alkyne RAFT molecules. CuAAC coupling resulted in stoichiometric conversions giving desired branched peptide oligomers in moderate to good yields. One construct contained four copies of an RGD sequence and a fluorescent label. The addressed bioactive peptide ligand can bind to GPIIb/IIIa receptor molecules and, thus, inhibit platelet aggregation. This scaffold-based multivalent construct may be suitable for fluorescence microscopy of GPIIb/IIIa-expressing cells and have anticoagulant activity. However, detailed biological assays have not been conducted owing to a low expected therapeutic or diagnostic benefit. Additionally, it has to be stated that to date more advanced bioconjugation techniques are available eliminating the need for transition metal catalysis. Nevertheless, the reported study provides a blueprint for the successful synthesis of heteromultivalent peptide conjugates and the described methodologies still find application in the Kolmar group for the “scaffolding” of other ligand molecules possessing therapeutic and diagnostic potential.
One very promising application of 1,2,3-triazoles relies on their ability to form hydrogen bonds, their polarity, and a good solubility in water. These features render this nitrogen-containing aromatic heterocycle a suitable hydrolysis-resistant mimic of amide bonds. The possibility to synthesize 1,4- or 1,5-disubstituted 1,2,3-triazoles through the choice of transition metal catalyst allows for the generation of amide mimics locked either in trans or cis conformation, respectively. This concept has been applied to the design and synthesis of peptidomimetic variants of monocyclic sunflower trypsin inhibitor-1 (SFTI-1[1,14]). For this purpose, a combination of microwave-assisted Fmoc-based solid phase peptide synthesis and on-support CuAAC as well as RuAAC was used yielding desired compounds in sufficient amounts for structural analysis and in vitro inhibition assays. The solution of crystal structures of trypsin-inhibitor complexes through X-ray diffraction crystallography undoubtedly proved the successful synthesis of functional peptidomimetics. Moreover, it has been shown that a backbone shape corresponding to the sterically unfavorable cis isomer can be enforced at positions of choice within a given peptide sequence. This eliminates the need for proline side chains after cis-amides and gives rise to novel peptide structures that would not be accessable using only canonical amino acids. As expected, it was observed that locking the opposite conformation to the native structure of SFTI-1 results in a detrimental effect on bioactivity. Additionally, the possibility for protection of certain backbone segments towards enzymatic hydrolysis is provided which gives rise to an enhanced in vivo stability.
In two other studies we investigated the effect of 1,2,3-triazole-based disulfide replacements on the biological activity of SFTI-1[1,14]. Four side-chain-to-side-chain macrocyclization motifs differing in length and shape were installed instead of the native cystine using commercially available azide- and alkyne-bearing building blocks. This was achieved via microwave-assisted Fmoc-SPPS followed by intrachain RuAAC or CuAAC on the solid support or in solution, respectively. This yielded “triazole-bridged” peptidomimetic compounds possessing either a 1,4- or a 1,5-disubstitution pattern. Pure products were characterized by IR and 2D NMR spectroscopy as well as ESI-MS analysis. In vitro inhibition assays revealed that the substitution pattern of the macrocyclization motif had a dramatic effect on bioactivity. Interestingly, the variants possessing a 1,5-disubstitution pattern were potent inhibitors of trypsin with substrate-independent inhibition constants Ki in the single-digit nanomolar to subnanomolar range. However, the 1,4-patterned counterparts showed a significantly decreased bioactivity compared to the wild-type peptide. The linker length between the peptide backbone and the triazole moiety did not have such a pronounced influence. The in vitro results were corroborated by molecular modeling indicating that the RuAAC products provided a better overall fit to the structure of the parent peptide. Thus, the use of 1,5-disubstituted 1,2,3-triazoles as disulfide replacements is recommended. However, the adequate linker length has to be determined individually for a particular biological context.
The SFTI-1 variants containing “triazole bridges” as well as mono- and bicyclic SFTI-1 have also been tested for activity against the pharmacologically relevant type II transmembrane serine protease matriptase. Surprisingly, all of these six peptides possessed a dramatically decreased affinity towards this pharmacologically relevant enzyme compared to trypsin. This was unexpected as the negative electrostatic surface potential around the active site of matriptase should provide significant attractive contributions to the binding of the positively charged SFTI-1 framework. To further study this counterintuitive result, a two-step in silico experiment was set up using the YASARA structure software package and a customized AMBER-based force field. First, a molecular dynamics simulation was performed. Then, 100 snapshots from the resulting trajectories were used for a local docking experiment applying the AUTODOCK algorithm. This allowed for the calculation of free energies of binding for every inhibitor-enzyme complex. Indeed, the yielded in silico affinities hinted towards a tighter interaction between the SFTI-1 framework and matriptase compared to trypsin binding. Nevertheless, a significantly reduced success rate to hit the obligatory canonical orientation was observed for docking experiments to matriptase compared to trypsin. Normalization of computed free energies of binding by this hit factor reflected the affinities determined in vitro quite well. Subsequent structural analysis of the simulated peptides and calculation of route-mean-square deviations (RMSD) for certain segments of the SFTI-1 variants gave rise to the assumption that entropic penalties originating from the terminal regions caused the reduced potencies of the investigated peptides against matriptase in comparison to trypsin.
These in silico results delivered useful information for possible optimization strategies which were addressed in another study. Due to the observation of a slight preference of the monocyclic variant of SFTI-1 (SFTI-1[1,14]) in matriptase inhibition, this peptide was used as a lead compound for further investigations. Initial structure-guided considerations allowed for the identification of three positions within the peptide sequence that provided the potential for incremental beneficial modifications. Two of these residues were individually furnished with azide-bearing non-natural building blocks to facilitate a divergent synthetic strategy via a combinatorial approach. Additionally, substitutions with selected canonical amino acids were performed. This procedure enabled to rapidly generate a small compound library of 22 peptides possessing different singular side-chain modifications. Matriptase inhibition assays revealed several beneficial side-chain replacements. The most favorable modifications were merged into one compound, which demonstrated a Ki in the single-digit nanomolar range. Notably, this variant now referred to as SFTI-1-derived matriptase inhibitor-1 (SDMI-1) contained only standard amino acids, although significant improvements of matriptase affinity were observed for triazole-containing compounds as well. This demonstrates the utility of this “click-library” approach for the rapid screening of diverse side-chain functionalities for desired effects.
As mentioned before, a possible entropic penalty arising from the secondary loop of SFTI-1 upon binding was assumed to impair matriptase affinity. Thus, the C-terminal region of SDMI-1 was truncated by two residues resulting in the dodecapeptide SDMI-2. This compound possesses a similar activity towards matriptase as SDMI-1 but has an improved selectivity profile as it is sixfold less potent against trypsin. The developed compounds might be valuable platforms for further studies and are currently under consideration for a possible patent application. For example, the direct attachment of radiotracers suitable for PET/SPECT methodologies would enable the utilization as diagnostic tools for in vivo imaging. However, the potential for additional improvements of this peptidic framework towards matriptase or other pharmaceutically relevant proteases is not yet exhausted. | nicht bekannt |
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