Rhiel, Laura (2013)
Nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von Antikörpern auf Hefezellen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung
Kurzbeschreibung (Abstract)
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Prüfung eines Verfahrens zur nicht-kovalenten Präsentation von Antikörpern, Antikörper-abgeleiteten Molekülen sowie darauf basierenden Molekülbibliotheken auf der Oberfläche von Hefezellen als Technologie im Prozess der pharmazeutischen Wirkstofffindung.
Die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation ermöglicht die Selektion von spezifischen Molekülvarianten mittels Hochdurchsatz-Durchmusterung sowie die nachfolgende Induktions-gesteuerte Sekretion des selektierten Bindemoleküls in den Kulturüberstand zur Produktion und biochemischen Charakterisierung ohne Wirtswechsel. Im Mittelpunkt steht die erfolgreiche Kombination von Selektion und Produktion mit dem zeitsparenden Verzicht auf Subklonierungen und Reformatierungsschritte, die bei vergleichbaren Methoden nötig sind. Dadurch kommt es zu einer enormen Vereinfachung und Beschleunigung von sich anschließenden Prozessschritten der Wirkstofffindung. Durch die Verwendung einer Fc-Bindedomäne als Vermittlermolekül der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen und Fc-Fusionsproteinen ist es möglich, selektiv zwischen Oberflächenpräsentation und Sekretion in das Kulturmedium zu schalten. Erreicht wird das durch einen induzierbaren Expressionsmodus, wodurch leicht zwischen Membran-gebundener und löslicher Expression geschaltet werden kann. Der Vorteil dieses Verfahrens ist das einheitliche und finale Proteinformat während Präsentation, Selektion und löslicher Charakterisierung und die dadurch gewährleistete Reproduzierbarkeit von Proteineigenschaften in diesen Prozessschritten.
Die Kernfrage der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Verifizierung der Genotyp/Phänotyp-Kopplung zwischen präsentierter Proteinvariante und genetischer Information in der Zelle, da durch die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation nicht per se von einer stabilen Kopplung ausgegangen werden konnte. Zu diesem Zweck wurden erfolgreich verschiedene Mischungsexperimente durchgeführt. Des weiteren wurden verschiedene VHH-Bibliotheken mit in vitro und in vivo Diversifizierungstechniken erstellt und charakterisiert und diese unter Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens nach Varianten mit gewünschten Eigenschaften mittels magnetisch- und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (MACS und FACS) durchmustert.
| Typ des Eintrags: |
Dissertation
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| Erschienen: |
2013 |
| Autor(en): |
Rhiel, Laura |
| Art des Eintrags: |
Erstveröffentlichung |
| Titel: |
Nicht-kovalente Oberflächenpräsentation von Antikörpern auf Hefezellen |
| Sprache: |
Deutsch |
| Referenten: |
Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried |
| Publikationsjahr: |
2013 |
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Datum der mündlichen Prüfung: |
11 Dezember 2012 |
| URL / URN: |
http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/3271/ |
| Kurzbeschreibung (Abstract): |
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Prüfung eines Verfahrens zur nicht-kovalenten Präsentation von Antikörpern, Antikörper-abgeleiteten Molekülen sowie darauf basierenden Molekülbibliotheken auf der Oberfläche von Hefezellen als Technologie im Prozess der pharmazeutischen Wirkstofffindung.
Die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation ermöglicht die Selektion von spezifischen Molekülvarianten mittels Hochdurchsatz-Durchmusterung sowie die nachfolgende Induktions-gesteuerte Sekretion des selektierten Bindemoleküls in den Kulturüberstand zur Produktion und biochemischen Charakterisierung ohne Wirtswechsel. Im Mittelpunkt steht die erfolgreiche Kombination von Selektion und Produktion mit dem zeitsparenden Verzicht auf Subklonierungen und Reformatierungsschritte, die bei vergleichbaren Methoden nötig sind. Dadurch kommt es zu einer enormen Vereinfachung und Beschleunigung von sich anschließenden Prozessschritten der Wirkstofffindung. Durch die Verwendung einer Fc-Bindedomäne als Vermittlermolekül der nicht-kovalenten Oberflächenpräsentation von IgG-Molekülen und Fc-Fusionsproteinen ist es möglich, selektiv zwischen Oberflächenpräsentation und Sekretion in das Kulturmedium zu schalten. Erreicht wird das durch einen induzierbaren Expressionsmodus, wodurch leicht zwischen Membran-gebundener und löslicher Expression geschaltet werden kann. Der Vorteil dieses Verfahrens ist das einheitliche und finale Proteinformat während Präsentation, Selektion und löslicher Charakterisierung und die dadurch gewährleistete Reproduzierbarkeit von Proteineigenschaften in diesen Prozessschritten.
Die Kernfrage der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit der Verifizierung der Genotyp/Phänotyp-Kopplung zwischen präsentierter Proteinvariante und genetischer Information in der Zelle, da durch die nicht-kovalente Oberflächenpräsentation nicht per se von einer stabilen Kopplung ausgegangen werden konnte. Zu diesem Zweck wurden erfolgreich verschiedene Mischungsexperimente durchgeführt. Des weiteren wurden verschiedene VHH-Bibliotheken mit in vitro und in vivo Diversifizierungstechniken erstellt und charakterisiert und diese unter Verwendung des nicht-kovalenten Verfahrens nach Varianten mit gewünschten Eigenschaften mittels magnetisch- und Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (MACS und FACS) durchmustert.
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Alternatives oder übersetztes Abstract: |
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Alternatives Abstract | Sprache |
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The aim of the study presented herein was the development and examination of a system for the non-covalent display of antibodies and antibody-derived molecules as well as libraries thereof on the surface of yeast cells as a technology for drug discovery.
The method of non-covalent way surface display enables the selection of specific variants via high-throughput-screening and the subsequent switchable secretion of the selected binder into the supernatant for production and biochemical characterization without changing the expression host. The key-point is the successful combination of selection and production to circumvent time-consuming sub-cloning steps that are necessary within the traditional technologies. Due to the utilization of a Fc-binding domain as a mediator of non-covalent display of IgG and Fc-fusion molecules it is possible to selectively switch between surface display and soluble secretion. This can be achieved by an inducible expression mode that can easily be switched between membrane-bound and soluble expression. The main advantage of this approach is the display, selection and production of these proteins in their final format, which ensures reproducible protein-features within each of the before-mentioned steps.
The key-issue in this work was to verify a stable genotype/phenotype-coupling between displayed protein variant and cellular genetic information which is a requirement for successful selection strategies. This was achieved by successfully conducting several spiking experiments. Furthermore different VHH-libraries were created with common in vitro and in vivo diversification technologies and screened within this new yeast display platform for variants with desired properties and needs by utilizing MACS and FACS.
| Englisch |
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| URN: |
urn:nbn:de:tuda-tuprints-32710 |
| Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): |
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Fachbereich(e)/-gebiet(e): |
07 Fachbereich Chemie |
| Hinterlegungsdatum: |
18 Mär 2013 16:25 |
| Letzte Änderung: |
21 Mär 2013 10:02 |
| PPN: |
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| Referenten: |
Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried |
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Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: |
11 Dezember 2012 |
| Export: |
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