Marschaus, Larissa Renée (2012)
Analyse einer divergenten Promotorregion in Halobacterium salinarum: Wirkung einzelner Promotorelemente und Stärke der Aktivierung.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Das halophile Archaeon Halobacterium salinarum PHH1 bildet Gasvesikel über 14 gvp-Gene, die in den zwei gegenläufig orientierten Genclustern gvpACNO und gvpDEFGHIJKLM angeordnet sind. Die Promotoren der Gene gvpA (PA) und gvpD (PD) sind nur 35 Nukleotide voneinander getrennt. PA weist dabei die stärkere, PD eine schwächere Aktivität auf. Reguliert wird die Gasvesikelbildung durch den Transkriptionsaktivator GvpE, während GvpD an der Repression beteiligt ist. Für die GvpE-vermittelt Aktivierung der Promotoren PA und PD ist jeweils eine 20 Nukleotide (nt) lange GvpE upstream activator sequence (GvpE-UAS) notwendig, die an das Promotormotiv BRE angrenzt, das dem Transkriptionsfaktor B (TFB) als Erkennungsstelle dient. Die GvpE-UAS enthält zwei 8 nt langen Elemente (1+2), die durch 4 nt voneinander getrennt sind. Aufgrund des geringen räumlichen Abstands von PA und PD überlappen die beiden distalen GvpE-UAS-Elemente 1A und 1D im Zentrum der intergenen Region fast vollständig. Die Eigenschaften der GvpE-UAS von PA und PD wurden näher untersucht. Dafür wurden Substitutionsmutagenesen durchgeführt, um die Signifikanz der 8-nt Elemente 1A+2A, sowie 1D+2D für die Aktivierung des entsprechenden Promotors in vivo zu bestimmen. Die beiden Promotoren wurden dazu sowohl einzeln (PA-bgaH und PD-bgaH Konstrukte) als auch in dualen Promotorkonstrukten (pApD-bgaH und pDpA-bgaH) bezüglich ihrer basalen und GvpE-induzierten Aktivität in Haloferax volcanii Transformanten untersucht. Der bgaH-Leserahmen diente dabei als Reporter; die BgaH-Aktivität kann über einen ONPG-Test quantifiziert werden. In den dualen Promotorkonstrukten wurde die Aktivität des jeweilig anderen Promotors über die Menge der p-gvpA- bzw. p-gvpD-Transkripte bestimmt. Die Substitution von einem der beiden PA-GvpE-UAS-Elemente 1A oder 2A mit einer nonsense Sequenz (1A+∆2A bzw. ∆1A+2A) führte zu einem Verlust der Aktivierung von PA, während die Konfiguration 1A+1A der PA-GvpE-UAS eine Reduktion der Aktivierung zur Folge hatte. Die basale und GvpE-stimulierte Promotoraktivität von PD blieb dagegen - mit der Ausnahme von ∆1A+2A - durch diese PA-GvpE-UAS-Substitutionen unbeeinflusst: Die Substitution ∆1A+2A der PA-GvpE-UAS führte zu einer Reduktion der GvpE-vermittelten PD-Aktivierung. Bei der Aktivatorsequenz von PD führte die Konfiguration 1D+1D zu einem Verlust (Einzelpromotorkonstrukt) bzw. einer starken Einschränkung (duales Promotorkonstrukt) der GvpE-Aktivierung, was für eine sehr starke Orientierung der GvpE-UAS 1A/1D-Sequenz in Richtung PA spricht. Dies gewährleistet wahrscheinlich die effizientere Aktivierung von PA im Vergleich zu PD. Auch PD war in der GvpE-UAS-Konfiguration ∆1D+2D bzw. 1D+∆2D nicht mehr aktivierbar. Für die GvpE-vermittelte Aktivierung beider Promotoren ist deshalb eine vollständige GvpE-UAS aus zwei funktionalen 8-nt-Elementen notwendig. Die Konfiguration 2D+2D stimulierte den PD Promoter fast wie die Wildtyp-Konfiguration 1D+2D. Die basale und GvpE-stimulierte Promotoraktivität von PA wurde durch diese PD-GvpE-UAS-Substitutionen nicht beeinflusst. Die nahe Lokalisation der GvpE-UAS zur TFB-Bindestelle BRE impliziert, dass GvpE und TFB interagieren. Die Interaktion zwischen TfbC und GvpE wurde mittels Affinitätschromatographie gezeigt. Hier wurden auch verschiedene GvpE-Mutanten analysiert, die ihre Aktivatorfunktion verloren haben. Alle untersuchten GvpE-Mutanten hatten aber noch die Fähigkeit zur Interaktion mit TfbC. Um die Ursache für die Unterschiede in der Promotoraktivität von PA und PD zu bestimmen, wurden Promotorchimären hergestellt, bei denen die Motive BRE, TATA-Box und GvpE-UAS einzeln oder gemeinsam ausgetauscht waren. Durch den Austausch der GvpE-UAS wurde die Stärke der GvpE-vermittelten Promotoraktivierung ermittelt. PD wurde mit der PA-GvpE-UAS stärker und vice versa PA mit der PD-GvpE-UAS schwächer durch GvpE aktiviert. Alle PA-Motive waren in der Umgebung von PD funktional und der Austausch von BRE und/oder TATA-Box führte jeweils zu einer Erhöhung der GvpE-Aktivierung der PD-Chimäre. Dadurch wurde die Wichtigkeit von BREA und TATA-BoxA für die Stärke von PA belegt. Im Gegensatz dazu bewirkte BRED in der PA-Chimäre eine starke Reduktion der Basalaktivität und der GvpE-vermittelten Aktivierung. TATAA konnte jedoch gegen TATAD ohne Beeinflussung der Aktivität ausgetauscht werden. Die vollständige Inversion aller Promotorelemente übertrug die stärkere PA-Aktivität auf PD und vice versa die schwächere PD-Aktivität auf PA. Somit tragen alle Elemente des PA Promoters zur Stärke der Expression bei. Für PD wurde auch die Region zwischen TATA-Box und Transkriptionsstart durch eine 4-nt scanning Mutagenese gezielt analysiert. Es wurde ein neues regulatorisches Element zwischen TATAD und dem Transkriptionsstart identifiziert, das für die basale PD-Aktivität wichtig ist. Ein ähnliches Element existiert für PA nicht. Wegen des Funktionsverlustes von BRED in der Umgebung von PA und dem neuen regulatorischen Element in PD könnte PD von einem anderen TFB-Protein erkannt und gebunden werden als PA. Dies wäre eine mögliche Erklärung für die unterschiedliche, wachstumsphasenabhängige Aktivität beider Promotoren.

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