Wiegand, Stephan (2012)
Funktionelle Charakterisierung von RNA abhängigen RNA Polymerasen aus Dictyostelium discoideum.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Zellulär kodierte RNA abhängige RNA Polymerasen (RNA-dependent RNA polymerases, RdRPs) katalysieren die Synthese eines RNA Strangs komplementär zu einer einzelsträngigen RNA Matrize. RdRPs sind in vielen eukaryotischen Organismen in RNA-vermittelte Genregulationsprozesse involviert und in einigen Organismen notwendig für einen funktionierenden RNA Interferenz (RNAi) Mechanismus (zusammengefasst in Maida and Masutomi, 2011). Vor Beginn dieser Arbeit konnten im Genom von Dictyostelium discoideum drei Gene identifiziert werden, welche für die RdRP Homologe RrpA, RrpB und RrpC kodieren (Martens et al., 2002). Zur funktionellen Charakterisierung der RdRP Homologe in D. discoideum wurden mittels homologer Rekombination RdRP single, double und triple Deletionsstämme in allen möglichen Kombinationen generiert. Hierbei wurde zur Herstellung von Gendeletionsvektoren das pKOSG System entwickelt, das auf dem StarGate®-combinatorial cloning System und dem pLPBLP Vektor basiert (Wiegand et al., 2011). Die für die homologe Rekombination notwendigen Bereiche, können bei diesem System in Form von zwei PCR Produkten durch combinatorial cloning in einer höchst effizienten Einschritt-Reaktion in ein allgemeines, organismenspezifisches Akzeptor System integriert werden. In vergleichenden Studien von Gendeletionsvektoren, welche mittels konventioneller Klonierung erstellt wurden, konnten keine funktionellen Unterschiede festgestellt werden. Aufgrund des deutlich reduzierten Zeit- und Materialaufwands bei der Erstellung von Gendeletionsvektoren, stellt das neu entwickelte pKOSG System eine deutliche Verbesserung gegenüber einer konventionellen Klonierungsstrategie dar. Im Weiteren wurde der Einfluss von RdRPs und DrnB, einem Dicer-ähnlichen Protein in D. discoideum, auf endogene RNAs untersucht. Zunächst wurde festgestellt, dass RdRPs in D. discoideum nicht essentiell sind. Dennoch haben sie eine zentrale Funktion im RNA vermittelten Stilllegungsmechanismus der LTR Retrotransposons DIRS-1 und Skipper. Hierbei wurde in Northern Analysen erstmalig eine bidirektionale Transkription von DIRS-1 Elementen detektiert. Des Weiteren konnte eine drastische Reduktion von DIRS-1 spezifischen siRNAs in Northern Blots und in deep sequencing Analysen in allen untersuchten rrpC Deletionsstämmen festgestellt werden. Parallel wurde eine Akkumulation von DIRS-1 sense Transkripten in diesen Stämmen beobachtet. Mit Hilfe dieser Ergebnisse lässt sich ein Modell für einen RNA-vermittelten Stilllegungsmechanismus von DIRS-1 postulieren. Bidirektionale DIRS-1 Transkripte, welche aus der Promotoraktivität der invertierten LTRs resultieren, werden demnach zunächst durch das Dicer-ähnliche Protein DrnA zu primären siRNAs prozessiert. Im Folgenden vermittelt RrpC die Synthese von sekundären siRNAs, wobei primäre siRNAs als Primer an der DIRS-1 sense RNA fungieren. Die durch RrpC synthetisierten Doppelstränge werden wiederum durch DrnA geschnitten woraus ein post-transkriptioneller Abbau der DIRS-1 sense Transkripte resultiert. Im Gegensatz zu DIRS-1 siRNAs akkumulierten Skipper spezifische siRNAs in rrpC Deletionsstämmen. Überraschenderweise wurde eine Anreicherung von längeren Skipper spezifischen Transkripten in rrpA Deletionsstämmen und vor allem im drnB Deletionsstamm beobachtet. Darüber hinaus konnte in rrpC Deletionsstämmen eine drastische Akkumulation von zwei putativen micro RNAs detektiert werden. Dies deutet auf mögliche regulatorische Funktionen von RrpC in der Biogenese von micro RNAs hin, was im Einklang mit bereits publizierten Untersuchungen steht (Hinas et al., 2007). Zur Analyse des RNAi Mechanismus in D. discoideum wurden zwei Reportersysteme entwickelt. Im ersten konnte die Menge an mRNA des Endogens cadA durch Transkription von extrachromosomalen sequenzhomologen cadA Silencing Konstrukten reduziert werden. Nur durch Einsatz eines hairpin Konstrukts, welches annährend die gesamte kodierende Sequenz von cadA abdeckte, konnte eine Reduktion der mRNA in allen RdRP Deletionsstämmen ausgelöst werden. Bei Expression von kürzeren hairpin RNAs sowie bei antisense RNAs wurden dagegen keine Veränderungen beobachtet. CadA spezifische siRNAs, welche aus der Prozessierung des primären Auslösers resultieren, konnten dagegen für alle exprimierten hairpin und antisense RNAs nachgewiesen werden, wobei deren Menge und Prozessierung unabhängig von der Aktivität von RdRPs erfolgte, da sich alle untersuchten RdRP Deletionsstämme wie der AX2 Wildtyp verhielten. Mit dem ß-Gal Reportersystem konnte ein zweites, heterologes System zur Untersuchung von RNA-vermittelten Genregulationsprozessen in D. discoideum etabliert werden. Die Expression des Transgens lacZ und die nachfolgende Expression von sequenzhomologen ß-gal Silencing Konstrukten, erfolgte hierbei von zwei getrennten Vektoren mit unterschiedlichen Selektionsmarkern. Die ß-Gal Aktivität konnte durch Expression einer hairpin RNA, aber auch durch Expression einer antisense RNA im AX2 Wildtyp und in allen untersuchten RdRP und drnB Deletionsstämmen um mindestens 50% reduziert werden. Dies wurde jedoch nicht durch eine Reduktion der lacZ mRNA Menge verursacht, die in beiden Fällen konstant blieb. Nachweise von siRNAs nach Expression der ß-gal hairpin RNA zeigten, dass eine Prozessierung zu siRNAs erfolgte, was in schwächerem Maße auch für die antisense RNA beobachtet wurde. Diese wirken demnach als Inhibitoren der Translation. Zusätzlich wurde nach Expression der ß-gal hairpin RNA ein spreading von ß-gal siRNAs 5´ zur Position des primären Auslöser beobachtet. Die Entstehung dieser sekundären siRNAs erfolgte in Abhängigkeit von rrpC und drnB. Die Ergebnisse beider Reportersysteme deuten darauf hin, dass RdRPs nicht zwingend notwendig für RNAi-vermitteltes post-transkriptionelles Silencing und translationale Repression in D. discoideum sind.

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