Paschke, Maren (2012)
Entwicklung biotechnologischer Werkzeuge zur enzymkatalysierten Produktion makrozyklischer Moschusriechstoffe.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Ziel dieser Arbeit war es, einen experimentellen Zugang zu schaffen, um mit Hilfe eines Klasse I-Aldolase-Mechanismus über eine Schiffbasen-Bildung die Zyklisierung eines linearen Diketons zu bewirken. Dazu wurden zunächst geeignete Proteingerüste ausgewählt, welche in Hinsicht auf der Größe und der Ladungen im Inneren ihrer Substrattasche, in der Lage sein sollten, eine solche Reaktion zu katalysieren. Durch den Einbau von Lysinresten an ausgewählten Aminosäure-Positionen im Inneren des aktiven Zentrums der Proteingerüste sollte die Aldolase-Reaktion über eine Schiffbasen-Bildung initiiert werden. Es konnte jedoch nicht gezeigt werden, dass die eingebauten Lysinreste mit dem Aldol-Marker Methodol reagieren. Da vermutet wurde, dass die installierten Lysinreste im Innern der Substrattasche nicht aktiv waren, wurden Aminosäuren in der näheren Umgebung der Lysinreste in einem Substratspezifischen Radius von 9 Å ausgesucht und über SOE-PCR mit degenerierten Primern die randomisierten Stellen eingebaut. Durch den Einfluss der zufällig eingebauten Aminosäuren sollten die installierten Lysinreste aktiviert werden. Zur Identifizierung aktiver Lysinreste wurden mehrere Muteinbibliotheken auf der Basis des Proteingerüstes der Polyketid-Cyclase SnoaL erstellt. Es wurden Display-Verfahren etabliert und die SnoaL-Muteinbibliotheken im Hochdurchsatz-Verfahren durchmustert. Für die Durchmusterung im Hochdurchsatz-Verfahren wurden sogenannte Suizid-Substrate synthetisiert, welche mit dem funktionellen Lysinrest über eine Schiffbase eine kovalente Bindung eingehen und somit als Marker für eine Klasse I Aldolase-Reaktion fungieren können. Es traten jedoch große Schwierigkeiten bei der Reinigung dieser Substrate auf. Außerdem mussten die Diketon-Derivate für den Einsatz des High-Throughput-Screenings durch die Kopplung eines Biotin-Linkers funktionalisiert werden. Auch hier erwies sich die Trennung der eingesetzten Edukte von dem gewünschten Produkt als äußerst schwierig und Letztere zeigten außerdem eine geringe Stabilität selbst bei -20 °C. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit war die Isolation katalytischer Aldolase-Antikörper aus einer synthetischen und einer naiven VHH-Bibliothek. Aber auch aus diesen Bibliotheken konnte kein Substrat-Binder isoliert werden. Da bereits gezeigt werden konnte, dass mit Hilfe eines Hapten-Konjugats aus Diketon-Derivat und KLH durch Immunisierung mehrere Aldolase-Antikörper isoliert wurden (Barbas, 1997; Zhong, 1999), wurde diese Methode ebenfalls zur Gewinnung katalytischer Antikörper herangezogen. Da nach katalytischen Schwere-Ketten-Antikörpern gesucht wurde, erfolgte die Immunisierung eines Lamas mit dem Suizidsubstrat als Hapten-Konjugat. Wenn auch die Isolierung von SnoaL-Varianten oder VHH Antikörpern mit Aldolase-Aktivität nicht erfolgreich war, wurden Möglichkeiten und Grenzen bezüglich Enzymgrundgerüst, Display-Strategie, Durchmusterungsverfahren und Substratsynthese ausgelotet, die eine Risikobewertung und Kalkulation der Erfolgswahrscheinlichkeit künftiger, ähnlich gelagerter Produkte wesentlich erleichtern dürfte. Zusätzlich wurde für die spätere Quantifizierung der Produktbildung der Aldolase-Varianten ein kontinuierlicher Assay etabliert, bei dem mit Hilfe einer Cyclopentadecanone-Monooxygenase (CPDMO) ein Cofaktor-abhängiges, an die Produktbildung gekoppeltes Signal detektiert werden kann. Dafür konnte ein stabiles und reproduzierbares Expressionsystem aufgebaut werden.

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