Meyer, Barbara (2012)
Kernweite H2AX-Phosphorylierung nach Schwerionenbestrahlung.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Schwerionenstrahlen verursachen in der Zelle in Abhängigkeit von ihrer Energie lokalisierte, komplexe DNA-Schäden, die eine besondere Herausforderung für die Reparaturmechanismen der Zelle darstellen. Das Histon H2AX fördert die Reparatur von DNA-Schäden durch Akkumulation von Reparaturfaktoren in der Nähe der DNA-Schäden. Hierzu wird H2AX im Megabasenpaarbereich um DNA-Doppelstrangbrüche an Serin 139 phosphoryliert, wodurch γH2AX gebildet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass nach Induktion komplexer DNA-Schäden durch Schwerionenbestrahlung zusätzlich ein spezifisches, jedoch schwächeres γH2AX-Signal über den gesamten Zellkern verteilt entsteht. Dieser Prozess ist in humanen und murinen Zellen, sowie in Hamsterzellen konserviert und findet sowohl in normalen Fibroblasten als auch in Tumorzellen statt. Bei pan-nukleärem γH2AX handelt es sich nicht um aus dem Chromatin ausgetauschtes Histon, sondern H2AX wird auch im nicht beschädigten Bereich phosphoryliert, wobei dieser Prozess sowohl in der G1- als auch in der G2-Phase stattfindet. Ein möglicher Zusammenhang mit Apoptose, bei der ebenfalls eine kernweite H2AX-Phosphorylierung induziert wird, konnte durch zellmorphologische Untersuchungen, sowie Analyse mit Apoptosemarkern ausgeschlossen werden. Zur genaueren Charakterisierung der kernweiten Antwort wurde γH2AX mittels Immunfluoreszenzmikroskopie quantifiziert, wodurch eine Unterscheidung zwischen dem γH2AX-Signal an den DNA-Schäden und dem kernweiten γH2AX-Signal möglich war und die Signale der γH2AX-Foci zu einem großen Teil aus der Messung ausgeschlossen werden konnten. Dabei wurde die genaue Bestrahlung durch die Mikrosonde angewendet, die eine gezielte Lokalisierung einer definierten Anzahl an Ionen innerhalb des Zellkerns ermöglicht. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die kernweite Antwort nur nach Bestrahlung der Zellkerne, nicht aber des Cytoplasmas ausgelöst wird. Desweiteren nimmt die kernweite H2AX-Phosphorylierung eindeutig mit steigender Dosis zu, wobei γH2AX bei höheren Dosen langsamer ansteigt. Schon nach Bestrahlung mit einzelnen Kohlenstoffionen (ca. 0,2 Gy) wird diese Antwort induziert und ist bis zu einer Dosis von ca. 70 Gy nach Bestrahlung mit mehreren Goldionen nicht gesättigt, so dass γH2AX an den Foci immer noch stärker war als im unbeschädigten Bereich des Zellkerns. Es ist also keine Schwellendosis nötig, um diese Antwort auszulösen, so dass es möglich erscheint, dass dieser Prozess auch bei locker ionisierender Bestrahlung in geringem Umfang stattfinden könnte. Die Verteilung der Ionentreffer innerhalb des Zellkerns hatte keinen Einfluss auf die H2AX-Phosphorylierung. Die Untersuchung der kernweiten Antwort über die Zeit ergab, dass bereits eine Stunde nach Bestrahlung eine Rückbildung von kernweitem γH2AX beginnt und γH2AX wenige Stunden nach Bestrahlung auf einem niedrigen Niveau verbleibt. Interessanterweise ist die Rückbildung des pan-nukleären Signals unabhängig vom verwendeten Ion und der applizierten Dosis, während die Rückbildung der γH2AX-Foci eine langsamere Kinetik insbesondere nach höherem LET aufweist, da DNA-Schäden mit zunehmender Komplexität eine längere Reparaturzeit benötigen. Dies deutet darauf hin, dass die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen keine Voraussetzung für die Rückbildung von pan-nukleärem γH2AX ist. Es wurde eindeutig unter Verwendung von spezifischen Inhibitoren und defizienten Zellen gezeigt, dass die kernweite H2AX-Phosphorylierung von ATM und DNA-PK katalysiert wird, da die kernweite H2AX-Phosphorylierung erst durch Unterdrückung beider Kinasen vollständig inhibiert wurde. Bei Aktivität nur einer der beiden Kinasen wird die kernweite Antwort induziert, ist jedoch meist abgeschwächt. Der Verlust einer Kinase kann also nicht vollständig durch die andere Kinase kompensiert werden. ATM scheint bei einer Dosis von unter 10 Gy bereits vollständig aktiviert zu sein, während sich für DNA-PK abzeichnete, dass die Menge der aktivierten Kinase LET-abhängig ist und auch bei hohen Dosen bis 50 Gy noch weiter ansteigen kann. Dies könnte dazu führen, dass DNA-PK bei höheren Dosen eine immer stärkere Rolle im Vergleich zu ATM einnimmt. Es sind verschiedene Mechanismen vorstellbar, wie die kernweite H2AX-Phosphorylierung ausgelöst werden könnte. Es wird beschrieben, dass durch Bestrahlung Chromatinstrukturveränderungen über Acetylierung von Histonen induziert werden. Nach Schwerionenbestrahlung könnte eine globale acetylierungsabhängige Veränderung der Chromatinstruktur eine kernweite Kinase-Aktivierung bewirken. Daher wurde der Einfluss der Inhibition von Histondeacetylasen oder Acetyltransferasen auf die kernweite Antwort untersucht. Acetylierung war jedoch nicht nötig, um die kernweite Antwort zu induzieren und Hyperacetylierung löste die kernweite Antwort nicht aus, verstärkte diese jedoch nach Schwerionenbestrahlung, was mit einer verbesserten Zugänglichkeit von H2AX in Zusammenhang stehen könnte. Eine pan-nukleäre H2AX-Phosphorylierung kann auch beim Einbringen von DNA-Fragmenten in die Zelle ausgelöst werden, wodurch vor allem DNA-PK aktiviert wird. Nach Schwerionenbestrahlung entstehen DNA-Brüche in enger räumlicher Nähe zueinander, so dass DNA-Fragmente direkt oder auch durch Nuklease-Aktivität gefördert entstehen könnten. Um einen möglichen Einfluss von Nukleasen auf die kernweite H2AX-Phosphorylierung zu überprüfen, wurde die Expression von CtIP und Mre11 herunterreguliert. Beide Nukleasen scheinen jedoch nicht zu einer Verstärkung der kernweiten Antwort beizutragen, stattdessen scheint Mre11 die kernweite Antwort eher zu verringern. Dabei ist jedoch noch unklar, über welchen Mechanismus Mre11 diesen Effekt bewirken könnte. Desweiteren wäre es möglich, dass ATM und DNA-PK am DNA-Schaden aktiviert werden und von dort in aktiver Form für kurze Zeit durch den Zellkern diffundieren können. Allerdings ist eine Diffusion von DNA-PK in aktiver Form vom DNA-Ende weg bisher nicht beschrieben. Die genaue Ursache für die kernweite Antwort bleibt daher zunächst offen. Da γH2AX an DNA-Doppelstrangbrüchen die Akkumulation von Reparaturfaktoren fördert, wurde ein möglicher Einfluss von kernweitem γH2AX auf andere Reparaturkomponenten untersucht. Wie in der Nähe des DNA-Schadens besteht kernweit eine gegenseitige Abhängigkeit von γH2AX und MDC1, einem Mediatorprotein, das an DNA-Doppelstrangbrüchen die verstärkte Akkumulation von ATM und die Rekrutierung von 53BP1 vermittelt. Es wurde gezeigt, dass MDC1 an pan-nukleäres γH2AX bindet und dabei die Phosphorylierung von weiterem H2AX durch ATM und DNA-PK verstärkt. Die MDC1-Bindung am DNA-Schaden scheint dabei deutlich vermindert zu sein. 53BP1 hingegen bindet fest in der Nähe des DNA-Schadens, es konnte jedoch keine kernweite Bindung nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass pan-nukleär weitere für die 53BP1-Bindung nötige Signale fehlen. Die phosphorylierten Formen anderer Zielproteine von ATM und DNA-PK wie NBS1 und RPA zeigten kein starkes kernweites Signal. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die kernweite H2AX-Phosphorylierung die meisten Reparaturkomponenten und in diesem Zusammenhang wahrscheinlich die biologische Wirksamkeit von Schwerionenstrahlen nicht stark beeinflusst. Die Untersuchungen in dieser Arbeit liefern neue Einblicke in die Auswirkungen von Schwerionenbestrahlung auf molekularer Ebene und beschreiben eine neuartige kernweite Reaktion der Zelle auf die Induktion lokaler komplexer DNA-Schäden. Weitere Untersuchungen sind jedoch nötig, um diese Antwort vollständig zu verstehen.

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