Schumann, Eik (2011)
Wechselspiel zwischen Doppelstrangbruch-Reparatur und Zellzyklus-Kontrolle am G2/M-Übergang.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden das Checkpoint-Verhalten am G2/M-Übergang und die Reparatur der durch Röntgenstrahlen induzierten DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) in G2, M und der G1-Phase untersucht. Um diese Untersuchungen auf der Ebene einzelner Zellen durchzuführen, wurde die Technik der Lebendzellmikroskopie eingesetzt. Der erste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines Inkubators zur CO2-Inkubation während der Mikroskopie und der Optimierung der Versuchsabläufe in der Lebendzellmikroskopie. In Zusammenarbeit mit dem Hersteller wurde die Mikroskopie-Software um Funktionen erweitert, die das zyklische Anfahren multipler Positionen auf dem Objektträger und den Umgang mit einer großen Zahl an Bildern ermöglichte. Die Aufnahmebedingungen wurden optimiert, um eine Schädigung oder Beeinflussung der Zellkultur während der Mikroskopie zu vermeiden. Neben der Technik wurden Verfahren zur Messung des Mitotischen Index und zur Messung der Reparatur von DSBs in der Lebendzellmikroskopie entwickelt, bzw. etabliert. Nach der Etablierung und Optimierung der experimentellen Bedingungen in der Lebendzellmikroskopie wurde die Reparatur von DSBs über die Quantifizierung von GFP-53BP1-Foci untersucht und in Relation zum Zellzyklusverhalten gesetzt. Dabei zeigte sich, dass G2-bestrahlte Zellen einen G2/M-Checkpoint aktivieren, diesen jedoch zu Zeiten aufheben, zu dem die Zellen noch eine hohe Zahl an DSBs enthalten. Auf diese Weise gelangt eine beträchtliche Zahl von DSBs in die Mitose, was einen Befund aus weiteren Arbeiten unserer AG mit fixierten Zellen bestätigte. Die Lebendzellmikroskopie ermöglichte die Verfolgung der in G2 bestrahlten Zellen durch die Mitose und in die G1-Phase hinein und damit die Untersuchung des Schicksals dieser Zellen und der Konsequenzen einer Mitose in Anwesenheit von DSBs. Es stellte sich heraus, dass Zellen, die in G2 bestrahlt wurden und sich teilten, bis 10 h nach Bestrahlung einen höheren Foci-Level aufwiesen als Zellen, die in G1 bestrahlt wurden. Dies ließ darauf schließen, dass DSBs, welche die Mitose durchlaufen haben, in G1 schlechter repariert werden können. Die zur Kontrolle ausgewerteten Foci unbestrahlter Zellen zeigten, dass sich die Zahl spontaner Foci über die Mitose mehr als verdoppelt. Dieses Ergebnis wies auf einen Mechanismus während der Mitose hin, der die Zahl der DSBs vergrößert oder die Reparatur erschwert. Im Folgenden wurde die Mitose, die in ihr vorhandenen DSBs und die Verteilung dieser DSBs auf die Tochterzellen näher untersucht. Es konnte nachgewiesen werden, dass Röntgen-Bestrahlung von G2-Zellen Anaphase-Brücken induziert. Anaphase-Brücken sind DNA-Stränge, die während der Anaphase die zu trennenden Chromatiden verbinden. Dieser Befund war durch zwei Mechanismen erklärbar: (i) Fehlerhafte Reparatur über das Nicht-Homologe End-Joining (NHEJ) führt zu dizentrischen Chromosomen, deren Chromatiden in der Anaphase nicht sauber getrennt werden können. Nach der Ausbildung einer Anaphase-Brücke kommt es zum Reißen des Chromosoms und komplexen Schäden am Chromatin. (ii) Im Zuge der DSB-Reparatur über die Homologe Rekombination (HR) werden holliday-junctions zwischen Schwesterchromatiden ausgebildet. Wird der HR-Vorgang nicht vor der Anaphase abgeschlossen, sind die beteiligten Chromatiden nicht sauber trennbar und die resultierende Brücke reißt unter Entstehung größerer Schäden am Chromatin. Um die Rolle der HR und damit die Rolle der unvollständigen Reparatur vor der Checkpoint-Aufhebung für die Entstehung von Anaphase-Brücken zu überprüfen, wurde die HR über eine chemische Inhibition von ATM reduziert. Die Induktion von Anaphase-Brücken nach G2-Bestrahlung ließ sich dadurch vermindern, was tatsächlich auf eine Beteiligung der HR an den Prozessen hindeutet, die in der Mitose zu Anaphase-Brücken führen. Um die Vorgänge in der Mitose weiter zu untersuchen, wurde in der Lebendzellmikroskopie ein weiterer DSB-Marker, ein GFP-MDC1-Konstrukt eingesetzt. Im Gegensatz zu 53BP1, ist MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1) auch während der Mitose am DSB lokalisiert. Sowohl in bestrahlten als auch in unbestrahlten Zellen zeigte die Analyse der mitotischen Foci einen sprunghaften Anstieg der Foci-Zahl während der Anaphase auf. Diese Ergebnisse bekräftigten das Modell, dass sowohl spontane als auch durch Röntgenstrahlung induzierte DSBs in der Anaphase zu Strukturen führen, die nicht sauber getrennt werden können. Als Folge entstehen Brücken und zusätzliche, nur schwer zu reparierende Schäden am Chromatin. Da die in der Anaphase reißenden Strukturen und die Entstehung weiterer Schäden nicht mikroskopisch nachvollziehbar waren, wurde anhand eines mathematischen Ansatzes untersucht, ob die in G1 zu findenden Foci im Zusammenhang mit in der Anaphase reißenden Strukturen stehen. Nach obigem Modell sollten die DSBs nach der Anaphase an beiden Chromatiden gleichermaßen zu finden sein. Daher wurde die Verteilung spontaner und induzierter Foci, sowohl in fixierten als auch in lebenden Telophase-Zellen untersucht und gezeigt, dass die Foci-Differenz zwischen den Chromatinmassen in der Telophase geringer war, als statistisch zu erwarten war. Die untersuchten Foci waren also durch einen Mechanismus entstanden, der die DSBs paarweise auf die Schwesterzellen verteilt. Ähnlich zu den Anaphase-Brücken war es wiederrum möglich, durch chemische Inhibition der HR, die koordinierte Verteilung von Foci zu vermindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten somit darauf hin, dass ein erhöhter Foci-Level und langsamere Reparatur in G1 zumindest teilweise auf das Durchlaufen der Mitose mit HR-Intermediaten zurückzuführen ist. Dies würde bedeuten, dass ein vorzeitiges Aufheben des G2/M-Checkpoints bei nicht abgeschlossener Reparatur über HR die genomische Integrität gefährdet.

Frage zum Eintrag

Redaktionelle Details anzeigen