Hennig, Anna Carina (2011)
Effekte unterschiedlicher Expressionsstrategien auf die Lipidmodifikation von rekombinantem OspA in Tabak.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Zur Produktion therapeutisch relevanter Proteine stellen Pflanzen als Bioreaktoren kostengünstige Alternativen zu den herkömmlich genutzten Produktionsplattformen tierischer und prokaryotischer Zellen dar. Eine wichtige Voraussetzung für die Funktionalität therapeutischer Proteine ist eine korrekte posttranslationale Modifikation innerhalb der Pflanzenzelle. Proteine mit großem therapeutischen Potential sind bakterielle Lipoproteine, die als Pathogen Associated Molecular Patterns (PAMPs) vom Immunsystem erkannt werden und die Bildung reaktiver Antikörper stimulieren, wodurch sie erfolgreich als Impfstoffe gegen bakterielle Infektionskrankheiten genutzt werden können. Anhand des lipidierten bakteriellen Oberflächenproteins OspA des Spirocheten-Bakteriums Borrelia burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, konnte bereits gezeigt werden, dass Pflanzen zur Lipidmodifikation bakterieller Proteine fähig sind (Glenz et al., 2006). Transplastome Tabakpflanzen akkumulierten dabei eine lipidierte Form von OspA bis zu 1% des LGP, wobei die resultierende Lipidmodifikation im Chloroplasten unvollständig verlief. Wie sich in der vorliegenden Arbeit herausstellte, konnte die Proteinakkumulation von rekombinantem plastidärem OspA (rpOspA) in transplastomen Pflanzen durch einen alternativen Integrationsort im Chloroplastengenom von 1% auf 10%- 20% des LGP gesteigert werden und das zur Lipidierung nötige minimale Sequenzmotiv bestimmt werden. Dabei konnte auch gezeigt werden, dass das Cystein an Position +1 innerhalb der N-terminalen Signalsequenz eine zur Lipidmodifikation essentielle Aminosäure darstellt. Weiter konnte dargelegt werden, dass rpOspA in Abhängigkeit der zur Lipidierung notwendigen bakteriellen Signalsequenz in Assoziation zu den Membranen des Thylakoidsystems vorliegt und diese Lokalisation unabhängig von einer vorhandenen Lipidierung des Proteins erfolgt. Als Folge der Lokalisation des rekombinanten Proteins an den photochemisch aktiven Membranen konnte eine Störung des photosynthetischen Apparats und ein damit verbundener Vitalitätsverlust transplastomer Pflanzen beobachtet werden. Im Gegensatz dazu war in Abwesenheit einer Volllängesignalsequenz die Akkumulation einer nicht lipidierten Variante im plastidären Stroma bis zu einem Gehalt von 20% des LGP erhöht, ohne die Vitalität der Pflanzen zu beeinflussen. Neben der sterischen Inhibierung photochemisch aktiver Membranen konnte zudem ein negativer Effekt der Präsenz der bakteriellen Signalsequenz auf die Proteinstabilität beobachtet werden, der zu einer mangelnden Akkumulation des rekombinanten Proteins führte. Dieser Effekt konnte für weniger Protease-resistente Proteine wie YFP beobachtet werden, wobei eine Stabilisierung durch eine Fusion an das Protease- resistente OspA erzielt werden konnte. Neben den inhibitorischen Effekten der bakteriellen Signalsequenz von OspA auf Proteinakkumulation und Pflanzenvitalität transplastomer Pflanzen konnte auch unter Verwendung eines transienten Expressionssystems ein negativer Einfluss der bakteriellen Lipidierungssequenzen auf die Proteinakkumulationsrate festgestellt werden. Dieser war im Gegensatz zur plastidären Expression unabhängig vom Protease-resistenten Charakter des zu synthetisierenden Proteins. Ein Entfernen oder Verkürzen der N-terminalen Signalsequenz resultierte für beide Produktionssysteme in einer gesteigerten Proteinakkumulation. Aufgrund dieser Ergebnisse scheint eine effektive Produktion bakterieller Lipoproteine im Bioreaktor Pflanze daher zunächst nicht gegeben. Immunologische Untersuchungen an Mäusen zeigten jedoch, dass eine orale Applikation von transgenem OspA-Pflanzenmaterial, unabhängig vom Lipidierungsstatus des rekombinanten Proteins, zu einer Bildung reaktiver Antikörper führte. Im Falle einer Applikation von transgenem Pflanzenmaterial ist damit die Lipidierung von OspA für den therapeutischen Nutzen nicht zwingend erforderlich, so dass eine effektive Produktion einer OspA-Variante ohne bakterielle Signalsequenz in transplastomen Pflanzen kostengünstig erfolgen kann.

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