Barton, Olivia (2010)
Checkpointkontrolle und Reparatur Heterochromatin-assoziierter DNA-Doppelstrangbrüche in bestrahlten G2-Phase Zellen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Die vorliegende Arbeit ist in zwei Fragestellungen gegliedert. Der erste Teil befasst sich mit der Funktion des Tumorsuppressors p53 am Übergang von der G2-Phase in die Mitose. Dazu wurden Zellen mit unterschiedlichem p53-Status mit ionisierender Strahlung behandelt. Anschließend wurde der G2/M-Checkpoint mit biochemischen und durchflusszytometrischen Methoden analysiert. Die Untersuchungen ergaben, dass p53 keinen Einfluss auf die Initiation des G2/M-Checkpoints hat, aber eine Funktion bei der Aufrechterhaltung des G2-Arrests aufweist. Diese Funktion scheint jedoch vom Schadensniveau abhängig zu sein. So konnte gezeigt werden, dass in p53-defizienten Zellen Strahlendosen von 1 Gy einen verlängerten G2-Arrest auslösen, während bei Strahlendosen von 12 Gy der G2/M-Checkpoint verglichen mit p53-profizienten Zellen frühzeitig aufgehoben wird. Im weiteren Verlauf der Arbeit lag das Interesse mehr auf dem verlängerten G2-Arrest nach der Applikation von 1 Gy. Untersuchungen zum Reparaturvermögen p53-defizienter Zellen zeigten, dass ein Reparaturdefekt als Grund für den verlängerten G2-Arrest ausgeschlossen werden kann. Es kann vielmehr postuliert werden, dass p53 möglicherweise auf Ebene der Checkpointkinasen Chk1/Chk2 in die DNA-Schadensantwort eingreift und so den Wiedereintritt in den Zellzyklus nach der Induktion eines geringen Schadensniveaus ermöglicht. Eine genaue Beurteilung der Funktion von p53 ist anhand der durchgeführten Experimente abschließend jedoch nicht möglich. Durch die Untersuchungen am G2/M-Checkpoint konnte für das p53 ebenfalls eine Funktion in der Mitose nach strahleninduzierten DNA-Schäden nachgewiesen werden. Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass p53 in mitotischen Zellen, deren DNA geschädigt wurde, den Übergang in die G1-Phase fördert. Diese Erkenntnis liefert Ansatzpunkte für zukünftige Arbeiten. Der zweite Teil der Arbeit wendet sich der langsamen Komponente der DNA-Doppelstrangbruch- (DSB-) Reparatur in der G1- und G2-Phase zu. Über diese Komponente wird ein geringer Teil der strahleninduzierten DSBs beseitigt, während der Großteil der induzierten DSBs innerhalb der ersten 2 h über eine schnelle Kom-ponente repariert wird. Untersuchungen der DSB-Reparatur in Mutanten der homo-logen Rekombination (HR) sowie Mutanten des Nicht-Homologen End-Joinings (NHEJs) anhand der γH2AX-Foci-Analyse zeigten, dass in der G1-Phase die schnelle sowie die langsame Komponente über das NHEJ ablaufen. In der G2-Phase konnte dagegen nachgewiesen werden, dass die schnelle Reparatur über das NHEJ erfolgt, während die langsame Kinetik durch die HR gekennzeichnet ist. Weitere Untersuchungen zeigten, dass Artemis und ATM sowohl in die langsame Komponente der Reparatur in der G1- als auch in der G2-Phase involviert sind. Durch die Etablierung HR-spezifischer Nachweismethoden konnte für Artemis und ATM in der G2-Phase eine Beteiligung bei der HR aufgezeigt werden, während sie in der G1-Phase einen Weg des End-Joinings unterstützen. Die Artemis- und ATM-Abhängigkeit in der G2-Phase wird durch die Anresektion der DSBs, die von CtIP vermittelt wird, herbeigeführt. Überraschenderweise zeigte sich, dass auch in der G1-Phase die Anresektion der DSBs die Artemis- und ATM-Abhängigkeit hervorruft. Möglicherweise führt die Resektion der DSBs zur Ausbildung von sekundären Strukturen, die vor der Reparatur beseitigt werden müssen. Da für Artemis eine Endonukleaseaktivität beschrieben ist, kann angenommen werden, dass Artemis für die Prozessierung der Sekundärstrukturen vonnöten ist. Einblicke zu der Funktion von ATM bei der langsamen Reparaturkomponente lieferte die Tatsache, dass DSBs, die in der G2-Phase über die HR und in der G1-Phase über einen End-Joining-Weg repariert werden, im Heterochromatin lokalisiert sind. Da für die Proteinkinase ATM beschrieben wurde, dass es den Heterochromatin-bildenden Faktor Kap1 phosphoryliert und so zur Änderung des Kap1-abhängigen Heterochromatinstatus beiträgt, lässt sich vermuten, dass ATM bei der lokalen Öffnung des Heterochromatins beteiligt ist, die für eine erfolgreiche Reparatur strahleninduzierter DSBs essentiell ist. Dabei scheint die ATM-abhängige Änderung des Heterochromatinstatus für die Reparatur der resektierten DSBs von besonderer Bedeutung zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kontrolle des G2/M-Checkpoints näher beleuchtet werden. Zudem konnten Einblicke in das komplexe Reparaturverhalten in der G2- und G1-Phase gewonnen werden. Dabei stand die langsame Reparatur im Vordergrund, die als Folge der Lokalisation im Chromatin bzw. der Anresektion der DSBs abläuft und von Artemis- und ATM-abhängig ist. Diese Erkenntnisse helfen dabei, die Reparatur besser zu verstehen und bieten viele Ansatzpunkte für zukünftige Arbeiten.

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