Mesic, Ivana (2010)
Rolle der N-terminalen Domänen (NTDs) bei der Assemblierung und Funktion von N-Methyl-D-Aspartat (NMDA)-Rezeptoren.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) gehören zusammen mit den non-NMDA-Rezeptoren (AMPA- und Kainat-Rezeptoren) zu der Familie der ionotropen Glutamatrezeptoren (iGluRs). NMDARs sind wichtig für die Weiterleitung von exzitatorischen Signalen zwischen Neuronen, Prozesse wie Lernen und Gedächtnisbildung sowie die Pathophysiologie von neurologischen Erkrankungen. Das gemeinsame Merkmal der iGluRs ist ihr modularer Aufbau, wobei die jeweiligen Domänen eine vergleichbare Struktur sowie Funktion zu besitzen scheinen. Für die extrazellulär angeordneten N-terminalen Domänen (NTDs) wird angenommen, dass sie bei allen iGluRs die Determinanten der Assemblierung sind und bei den NMDARs zusätzlich die Modulation der Rezeptorfunktion bedingen. Der tetramere NMDAR ist aus homologen NR1-, NR2A-D- und NR3A-B-Untereinheiten aufgebaut. Der sogenannte ´konventionelle´ NMDAR setzt sich aus den Glyzin-bindenden NR1- und Glutamat-bindenden NR2-Untereinheiten zusammen. Die Ligandenbindungsdomänen (LBDs) dieser Untereinheiten bilden zweiblättrige Strukturen aus, welche in einer ´Rücken-an-Rücken´-Konformation angeordnet sind. Dadurch entstehen intermolekulare Wechselwirkungen im NR1/NR2-Hetero-Dimer, deren Stabilität das Ausmaß der NMDAR-Aktivierung und der Desensitisierung bestimmt. Aufgrunddessen wird das Hetero-Dimer als die funktionelle Einheit im Rezeptor angesehen. Beim NR1/NR3-Rezeptor, welcher durch Gylzin allein aktivierbar ist, bewirkt die Ligandierung der NR3-LBD die Aktivierung des Rezeptors. Die anschließende Ligandierung der NR1-LBD führt dagegen zur Inaktivierung, d.h. zur Auto-Inhibition des NR1/NR3-Rezeptors, deren Determinanten noch unbekannt sind. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es die Rolle der NTDs bei der Assemblierung, Stöchiometrie und Funktion von NMDARs zu untersuchen. Für die biochemische Analyse dieser Fragestellung wurden die NMDARs rekombinant in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und mit [35S]-Methionin bzw. Cy5 markiert. Anschließend folgte die affinitätschromatographische Aufreinigung über die Hexahistidyl-Markierung von einer der exprimierten Untereinheiten sowie die Analyse anhand der blau-nativen- und der SDS-Polyacrylamid-Gelelektophorese. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bei NMDARs die NTD-Deletion keine Auswirkung auf die Assemblierung, die Stöchiometrie oder die Zelloberflächen-Expression hatte. Zusammenfassend sind, im Unterschied zu den non-NMDARs, bei NMDARs die NTDs nicht für die Ausbildung funktioneller Rezeptoren notwendig. Die funktionelle Analyse der Glyzin-vermittelten Rezeptorströme von Wildtyp- und NTD-deletierten NR1/NR3A- und NR1/NR3B-Rezeptoren anhand der Zwei-Elektroden Spannungsklemme zeigte, dass die NTD-Deletion zur Aufhebung der NR1-LBD-vermittelten Auto-Inhibition führt. Somit bestimmen die NTDs das Ausmaß der Rezeptoreffizienz. Dieser Befund korreliert mit der Verringerung der Rezeptordesensitisierung bei NR1/NR3A-Rezeptoren. Für das Auftreten beider Effekte war schon die selektive NR3-NTD-Deletion ausreichend. NR1/NR3A/NR3B-Rezeptoren zeichnen sich durch große Glyzin-induzierte Rezeptorströme auf, die nicht auto-inhibiert werden. Im Einklang damit, hatte die NTD-Deletion keine Auswirkung auf die Rezeptoreffizienz. Die Aufhebung der Auto-Inhibition bei NR1/NR3A/NR3B-Rezeptoren und das Vorhandensein dieser bei NR1/NR3A- bzw. NR1/NR3B-Rezeptoren können auf Unterschiede in den Wechselwirkungen zwischen den funktionellen Einheiten zurückgeführt werden. Anders als bei NR1/NR3A- und NR1/NR3B-Rezeptoren, agiert bei NR1/NR3A/NR3B-Rezeptoren Zn2+ als ein hoch-affiner allosterischer Inhibitor von Glyzin-induzierten Strömen. Die Mutation der NR1-Glyzinbindetasche bedingt zwar ein geringeres Ausmaß der Zn2+-Inhibition, jedoch nicht deren Aufhebung. Somit besitzt Zn2+ mindestens eine weitere Bindestelle im NR1/NR3A/NR3B-Rezeptor. Die hier erhaltenen Daten zeigen auf, dass es andere Determinanten für die NMDAR-Assemblierung als die NTDs geben muss und diese sich somit in den verbleibenden NMDAR-Domänen befinden. Die Erkenntnisse über die NTD-bedingte Modulation der NR1/NR3-NMDA-Rezeptorfunktion können bei zukünftigen Studien als ein Mittel dienen, diese Rezeptoren in vivo, z.B. durch den Einsatz von spezifischen Proteasen, zu detektieren. Das Wissen der Eigenschaften von funktionellen Einheiten kann für die Aufklärung der vermeintlich konträr agierenden Hetero-Dimere in NR1/NR2/NR3-Rezeptoren, die bereits in vivo detektiert wurden, von großer Bedeutung sein.

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