Beucher, Andrea (2009)
Untersuchungen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen in der G2-Phase des Zellzyklus.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Diese Arbeit widmet sich der Untersuchung des Beitrags der verfügbaren Wege zur Reparatur von strahlen- und etoposidinduzierten DNA-Schäden in der G2-Phase des Zellzyklus. Hier stehen zwei Hauptreparaturwege zur Reparatur von Doppelstrangbrüchen (DSBs) zur Verfügung. Die Homologe Rekombination (HR) ermöglicht durch Sequenzabgleich mit homologen DNA-Regionen die fehlerfreie Reparatur des DNA-Schadens. Das NHEJ beruht auf der einfachen Verknüpfung von freien DNA-Enden. Die Reparatur erfolgt sehr schnell, allerdings birgt dieser Reparaturweg das Risiko von Mikrodeletionen und verläuft somit nicht zwangsweise fehlerfrei. Die Nuklease Artemis und die Proteinkinase ATM sind für die Reparatur einer Subpopulation strahleninduzierter DNA-Schäden von Bedeutung. Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von heterozygoten Mutationen der DNA-Reparaturfaktoren BRCA1 und BRCA2, die mit einer erblichen Prädisposition für Brustkrebs in Verbindung gebracht werden. Die Untersuchung des Reparaturvermögens stationärer BRCA1- bzw. BRCA2-Mutanten konnte keine Einschränkung der DNA-Reparatur nach ionisierender Bestrahlung (IR) nachweisen. Dieses Ergebnis wurde durch die Analyse von G1-Phase-Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur bestätigt. Auch in der G2-Phase hat eine heterozygote Mutation in BRCA1 keinen Einfluss auf die Reparaturkapazität der betroffenen Zellen. Die Aktivität des vorhandenen Restproteins scheint für eine vollständige Reparatur auszureichen. Dagegen führt eine heterozygote Mutation in BRCA2 zu einer Verminderung der DSB-Reparatur in der G2-Phase und resultiert in einem Defekt der langsamen Reparaturkomponente. Allerdings zeigen die untersuchten Mutanten trotz identischer Mutationen ein sehr heterogenes Reparaturverhalten, was einen Einfluss des genetischen Hintergrunds nahe legt. Aufgrund der geringen Kohortengröße der untersuchten Zelllinien und der in der Literatur kontrovers diskutierten Situation ist eine Beurteilung des Einflusses heterozygoter Mutationen in BRCA1 bzw. BRCA2 auf Basis der durchgeführten Experimente nicht abschließend möglich. Die Charakterisierung der homozygot defekten BRCA2-Mutante konnte eine Beteiligung der HR an der Reparatur strahleninduzierter DSBs in der G2-Phase nachweisen. Defekte in der HR betreffen ebenso wie Defizienzen in ATM und Artemis die langsame Komponente der Reparatur. Die Ähnlichkeiten in Verlauf der Reparaturkinetik und im Ausmaß des Reparaturdefekts von BRCA2-, ATM- und Artemis-defizienten Zellen eröffnet die Möglichkeit der Beteiligung dieser Reparaturfaktoren an einem gemeinsamen Reparaturweg. Epistasisanalysen mit einem spezifischen ATM-Inhibitor bestätigen diese Vermutung. BRCA2 ist ein etablierter HR-Faktor, wodurch ATM und Artemis in der G2-Phase mit der HR in Zusammenhang gebracht werden. Dieses Ergebnis ist sehr überraschend, da die ATM/Artemis-abhängige Reparatur in G1 als Unterweg des DNA-PK-abhängigen NHEJ betrachtet wird. Dagegen verläuft die Reparatur dieser Schäden in der G2-Phase unabhängig von funktionaler DNA-PK über den Reparaturweg der HR, wie durch Epistasisanalysen mit einem Inhibitor der DNA-PKcs gezeigt werden konnte. Somit wird der Großteil der IR induzierten DSBs sowohl in G1 wie auch in G2 durch die schnelle Komponente des NHEJ repariert. Die Reparaturfaktoren ATM und Artemis werden für die langsame Reparatur einer Subfraktion der strahleninduzierten DSBs benötigt. Diese werden in der G1-Phase unter Beteiligung funktionaler DNA-PK über NHEJ repariert, während die Reparatur in G2 DNA-PK-unabhängig durch HR fortgeführt wird. Der Heterochromatinanteil in humanen Zellen korreliert sehr gut mit dem Ausmaß der ATM/Artemis-abhängigen Reparatur. Dies könnte darauf hindeuten, dass heterochromatinassoziierte DSBs aufgrund ihrer Lokalisation zur erfolgreichen Reparatur ATM und Artemis benötigen. Die Funktion von ATM könnte in der Auflösung der dichtgepackten Heterochromatinstruktur liegen, wurde jedoch in dieser Arbeit nicht weiter untersucht. Die Rolle von Artemis wurde in Komplementationsexperimenten mit verschiedenen Artemis-Konstrukten charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Endonukleasefunktion von Artemis für eine vollständige Reparatur unabdingbar ist. Die Tatsache, dass etoposidinduzierte DNA-Schäden eine deutlich geringere Beteiligung von ATM und Artemis zeigen, deutet darauf hin, dass auch die Komplexität eines DNA-Schadens Einfluss auf die Reparatur hat. Chemisch induzierte DSBs weisen eine einheitliche, unkomplizierte Struktur auf und können aus diesem Grund ohne Beteiligung von ATM und Artemis auch im Heterochromatin durch NHEJ repariert werden. Dagegen könnte bei IR-induzierten DNA-Schäden die Struktur der DSBs in Kombination mit der Lokalisation des Bruchs die Abhängigkeit von ATM und Artemis bedingen. Sowohl die Lokalisation des DSBs im Heterochromatin wie auch die Komplexität eines DSBs führen zu einer Verzögerung der Reparatur. Möglicherweise entstehen während dieser Zeit, die der DSB in unrepariertem Zustand verbleibt, sekundäre Strukturen, die durch Artemis bearbeitet werden müssen. Nach der Bearbeitung durch ATM und Artemis werden die entsprechenden DNA-Schäden in G2 der HR zugeführt. Dies deutet darauf hin, dass diese Strukturen in frühen Bearbeitungsschritten der HR enstehen, unbearbeitet die Reparatur verhindern und den Bruch für die HR markieren. In der G1-Phase, in der keine HR zur Verfügung steht, müssen diese DNA-Schäden unter Beteiligung der DNA-PK über NHEJ repariert werden, während DNA-PK die Reparatur der anderen durch NHEJ reparierten DNA-Schäden lediglich erleichtert. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Reparatur von etoposidinduzierten, kovalent verknüpften DNA-Protein-Komplexen untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine direkte Beteiligung des MRN-Komplexes an der Reparatur dieser DNA-Schäden in der G1-Phase. Dabei ist vermutlich die Endonukleaseaktivität des Proteinkomplexes für die Entfernung des verknüpften Proteins mitsamt eines kurzen DNA-Fragments verantwortlich. Die entstehenden freien Enden können anschließend durch NHEJ verknüpft werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte Einblick in das komplexe Zusammenspiel der unterschiedlichen Reparaturwege in der G2-Phase des Zellzyklus gewonnen werden. Der Beitrag der HR zur Reparatur von DNA-Schäden konnte quantifiziert und der langsamen Komponente der Reparatur zugeordnet werden. Diese ist für die ATM/Artemis-abhängige Reparatur von DNA-Schäden zuständig, die in G1 durch DNA-PK-abhängiges NHEJ repariert werden, während in G2 die HR angeschlossen wird. Über die Faktoren, die den Bedarf an ATM und Artemis bedingen, konnten nur Vermutungen angestellt werden. Diese Aspekte sind allerdings noch nicht vollständig verstanden und sollten in zukünftigen Arbeiten weiter untersucht werden.

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