Die dreidimensionale Struktur nativer Editosomen aus afrikanischen Trypanosomen

Böhm, Cordula (2008)
Die dreidimensionale Struktur nativer Editosomen aus afrikanischen Trypanosomen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-10499

Kurzbeschreibung (Abstract)

RNA-Editing im Mitochondrium afrikanischer Trypanosomen generiert durch die Insertion und Deletion von ausschließlich Uridylatresten aus kryptischen Transkripten translationskompetente mRNAs. Dieser posttranskriptionale Prozess wird durch einen als Editosom bezeichneten Ribonukleoproteinkomplex bestehend aus mRNA, gRNA und bis zu 20 Proteinen katalysiert. Während die RNA- und Proteinkomponenten des Editosoms identifiziert und charakterisiert sind, ist über dessen strukturelle Organisation sowie über dessen Assemblierung und Dissoziation wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden Editosomen in unterschiedlichen Stadien der Editing-Reaktion durch tandem affinity purification unter physiologischen Bedingungen isoliert. Editosomen in der Initiations-, Prozessierungs- und Terminationsphase enthalten mRNA, gRNA und 12-15 Proteine in unterschiedlicher Zusammensetzung. Nur in der Prozessierungsphase der Editing-Reaktion konnten funktionale Editosomen isoliert werden. Editosomen in der Initiations- und Terminationsphase zeigten keine Aktivität. In allen Stadien der Editing-Reaktion liegen Editosomen unter steady state-Bedingungen sowohl als 20 S und 40 S Subpopulationen vor. Durch Transmissionselektronenmikroskopie wurden funktionale 20 S und 40 S Editosomen visualisiert. Durch eine als random conical tilt bezeichnete Methode wurde ihre dreidimensionale Struktur mit einer Auflösung von ~2 nm bestimmt. 20 S Editosomen haben eine elongierte, leicht gekrümmte Form. Sie bestehen aus zwei Subdomänen ähnlicher Größe, die über eine schmale Brücke miteinander verbunden sind. 20 S Editosomen haben eine Dimension von 21x15,5x14 nm, ein Molekulargewicht von 800±80 kDa, und einen Svedberg-Koeffizient von 21-26 S. 40 S Editosomen bestehen aus einer konvexen, elongierten Plattform, die sich an gegenüberliegenden Seiten zu globulären Domänen ausweitet. Auf die Plattform ist eine runde, asymmetrische Domäne aufgelagert. 40 S Editosomen haben eine Dimension von 26,5x20x17,5 nm, ein Molekulargewicht von 1,45±0,15 MDa, und einen Svedberg-Koeffizienten von 35-41 S. 20 S Editosomen stellen ein frühes Assemblierungsstadium der 40 S Editosomen dar. In einem dreidimensionalen Alignment konnte gezeigt werden, dass es sich bei den 20 S Editosomen um einen Teil der Plattform der 40 S Editosomen handelt. 20 S und 40 S Editosomen weisen ein ähnliches Proteinprofil auf, der Unterschied besteht hauptsächlich in ihrem RNA-Gehalt. 20 S Editosomen werden durch die Bindung von mRNA und gRNA in 40 S Editosomen konvertiert. Surface plasmon resonance-Messungen ergaben, dass sowohl gRNAs und mRNAs als auch ein gRNA/mRNA-Duplex mit einer Dissoziationskonstante im nanomolaren Bereich an 20 S Editosomen binden. Immunogold labeling-Experimente zeigten, dass 20 S Editosomen eine RNA-Bindestelle aufweisen.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2008

Autor(en):

Böhm, Cordula

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

Die dreidimensionale Struktur nativer Editosomen aus afrikanischen Trypanosomen

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich ; Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas

Publikationsjahr:

17 Juli 2008

Ort:

Darmstadt

Verlag:

Technische Universität

Datum der mündlichen Prüfung:

23 Juni 2008

URL / URN:

urn:nbn:de:tuda-tuprints-10499

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

Mitochondrial gene expression in African trypanosomes requires a unique posttranscriptional modification reaction known as RNA editing. During editing cryptic pre-mRNAs are converted into mature transcripts by the insertion and/or deletion of exclusively U nucleotides. The reaction is catalyzed by high molecular mass protein complexes, known as editosomes. Editosomes consist of about 20 individual proteins and interact with guide RNAs and pre-edited mRNAs. Although the inventory of the complexes has been studied in detail, their three dimensional architecture is not known today. In order to capture RNA editing complexes at near native conditions, tandem affinity purification was performed. By using three different editosomal "bait" proteins, complexes at different stages of the editing cycle were enriched. Editosomes in the initiation, processing and termination stage of the reaction consist of mRNA, gRNA and 12-15 proteins. Mass spectroscopy identified heterogenous complexes that differ in protein composition. Only editosomes isolated in the processing stage revealed an insertion as well as a deletion editing activity in vitro, whereas the initiation and termination complex was not editing competent. Under steady state conditions editosomes of all three stages were detected as two high molecular mass complexes about 20 S and 40 S in size. Functional 20 S and 40 S editosomes were visualized by single particle electron cryomicroscopy and the three dimensional structures of both complexes was determined at a resolution of about 2 nm. The 20 S editosome exhibits an elongated, bipartite overall shape with two approximately equally sized subdomains connected by a tight interface. It has a dimension of 21x15.5x14 nm and encloses a molecular mass of 800±80 Da. The 40 S editosome consists of an elongated platform density with a head-like and a foot-like element attached on opposite sides and a semiroundish back packed against the platform. It measures 26.5x20x17.5 nm and has a calculated molecular mass of 1.45±0.15 MDa. 20 S editosomes are an assembly stage of the 40 S editosomes. A three dimensional alignment suggests that the 20 S complex comprises a major portion of the platform density of the 40 S complex. Both complexes have a similar protein composition but differ in their RNA content. 20 S editosomes are converted into 40 S editosomes by binding of RNA. Surface plasmon resonance experiments showed that 20 S editosomes bind gRNA, mRNA and gRNA/mRNA-hybrids with nanomolar affinity and immunogold labeling experiments revealed one RNA binding site per 20 S editosome.

Englisch

Freie Schlagworte:

RNA-Editing, Trypanosomen

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