Untersuchungen des aeroben Schwefelstoffwechsels von Acidianus ambivalens

Müller, Fabian (2008)
Untersuchungen des aeroben Schwefelstoffwechsels von Acidianus ambivalens.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

URL / URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-10145

Kurzbeschreibung (Abstract)

In der vorliegenden Arbeit wurde der Schwefelstoffwechsel von aerob gewachsenen Zellen des extrem thermo- und acidophilen Archaeons Acidianus ambivalens untersucht. Zur Energiekonservierung oxidiert A. ambivalens elementaren Schwefel oder Tetrathionat (TT) über verschiedene Zwischenprodukte zur Schwefelsäure. Beim Wachstum mit Schwefel wird dieser im ersten Schritt durch die cytoplasmatische Schwefel-Oxygenase/-Reduktase (SOR) sauerstoffabhängig zu Sulfid und Sulfit disproportioniert, während Thiosulfat (TS) zusätzlich nicht-enzymatisch gebildet wird. In dieser Arbeit werden einige Enzyme beschrieben, die Sulfid, TS und TT weiter umsetzen. Die membranständige Thiosulfat-Chinon-Oxidoreduktase (TQO)oxidierte TS zu TT mit den nicht-nativen Elektronenakzeptoren Decylubichinon (DQ) oder Kaliumhexacyanoferrat. Die spezifische Aktivität mit DQ betrug 2,4 ± 0,08 U/(mg Protein) bei 80°C und mit Kaliumhexacyanoferrat maximal 73 U/(mg TQO) bei 92°C. Die Aktivierungsenergie lag bei 37,7 kJ/mol. Die Km-Werte betrugen 2,6 mM für TS, 5,87 μM für DQ und 3,4 mM für Kaliumhexacyanoferrat. Aufgrund des Elektronenakzeptors Chinon repräsentierte die TQO das erste Enzym einer neuen EC Klasse mit der Nummer 1.8.5.2. Fluoreszenzemissions- und Massenspektren zeigten, dass Caldariella Chinon, Menachinon und Sulfolobus Chinon an die TQO gebunden waren. Andere Cofaktoren wurden nicht gefunden. CD-Spektroskopie (Circulardichroismus) ergab einen durchschnittlichen Gehalt der α-Helices von 46 (+/- 2)% und der ß-Faltblätter von 11,6 (+/- 0,6)% für das Holoenzym. Die TQO – ein Heterotetramer (α2β2) mit einer molekularen Masse von 102 kDa - war aus zwei Untereinheiten mit den apparenten molekularen Massen von 16 und 28 kDa aufgebaut. Die größere Untereinheit war glycosyliert und identisch zu DoxA und die kleinere identisch zu DoxD. Beide Untereinheiten wurden zuvor als Teil des terminalen Chinol:Sauerstoff-Oxidoreduktase (Oxidase) Komplexes charakterisiert. In anaerob kultivierten A. ambivalens Zellen wurde weder durch Northern-Analyse doxDA-mRNA nachgewiesen noch TQO-Aktivität gemessen. Ein Sequenzvergleich der kombinierten DoxD und DoxA Aminosäuresequenzen ergab, dass verschiedene Homologe in anderen Sulfolobales, sowie in drei Bacteroides Stämmen und in dem acidophilen, Schwefel-oxidierenden Bakterium Acidithiobacillus ferrooxidans vorlagen. In aerob mit TT kultivierten Zellen wurde eine Tetrathionat-Hydrolase (TTH) Aktivität gemessen, deren Produkt unter anderen TS war. Die spezifische TTH-Aktivität der löslichen Fraktion betrug 44 mU/(mg Protein) und stellte das 63-fache der spezifischen Aktivität der entsprechenden Fraktion von mit Schwefel kultivierten Zellen dar. In zwei Reinigungsversuchen jeweils aus der löslichen Fraktion von mit TT kultivierten Zellen wurde die TTH um das 66- bzw. 89-fache mit einer spezifischen Aktivität von 2,9 bzw. 3,9 U/(mg Protein) angereichert. Trotzdem waren jeweils kontaminierende Proteine in erheblicher Anzahl vorhanden. Der Km-Wert betrug 1,3 mM TT und die maximale Geschwindigkeit (Vmax) 55 mU. Das pH-Optimum lag bei pH 1 und die Aktivität erhöhte sich jeweils mit steigender Temperatur bis zu 95°C. Die Aktivierungsenergie lag bei 29 kJ/mol. PQQ (Pyrrolochinolin-Chinon) erhöhte die TTH-Aktivität um das dreifache, was darauf hindeutete, dass PQQ ein Cofaktor der TTH sein könnte. Eine 27-fach höhere spezifische TTH-Aktivität wurde bei der Solubilisierung der TTH durch Spheroplastierung mit 10 mM EDTA als nach einem kompletten Zellaufschluss erhalten. Dies deutete darauf hin, dass die TTH extrazellulär im Pseudoperiplasma vorlag. Eine spezifische Sulfid-oxidierende Aktivität mit DQ als Elektronenakzeptor (SQO) von 0,32 U/(mg Protein) wurde in der Membran- aber nicht in der löslichen Fraktion von aerob mit Schwefel kultivierten A. ambivalens Zellen gemessen. Die SQO wurde aus dem Membransolubilisat um das 9-fache zu einer spezifischen Aktivität von 4,9 U/(mg Protein) säulenchromatographisch angereichert. Das Enzym war aber nicht rein und enthielt viele andere Proteine, so dass es nicht identifiziert werden konnte. Mit einer Sauerstoffelektrode wurden ein TS- und ein Sulifd-abhängiger Sauerstoffverbrauch jeweils durch die intakte Membran nachgewiesen, deren Aktivität jeweils sensitiv gegenüber Cynaid war. Die spezifische Aktivität betrug 6,8 bzw. 52 ± 5 nmol Sauerstoff/(min mg Gesamtprotein). Der Sulfid-abhängige Sauerstoffverbrauch folgte der Michaelis-Menten Kinetik mit einem Km-Wert von 0,13 mM Natriumsulfid, einem Vmax von 72,5 nmol Sauerstoff/(min mg Protein) und wurde durch die SQO-inhibierenden Chinonanaloga HQNO (Heptylhydroxyquinoline-N-oxide) und Stigmatellin inhibiert. Diese Ergebnisse wurden so interpretiert, dass jeweils in der Membran ein Elektronentransport von TS bzw. Sulfid, katalysiert durch die TQO bzw. SQO, auf die terminale Oxidase stattfindet. In ihrer Gesamtheit belegten die Resultate, dass A. ambivalens zur Energiegewinnung Elektronen aus der Oxidation der Schwefelverbindungen in die Atmungskette einbringt.

Typ des Eintrags:

Dissertation

Erschienen:

2008

Autor(en):

Müller, Fabian

Art des Eintrags:

Erstveröffentlichung

Titel:

Untersuchungen des aeroben Schwefelstoffwechsels von Acidianus ambivalens

Sprache:

Deutsch

Referenten:

Kletzin, PD Dr. Arnulf ; Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas

Publikationsjahr:

16 Juni 2008

Ort:

Darmstadt

Verlag:

Technische Universität

Datum der mündlichen Prüfung:

10 Juni 2008

URL / URN:

urn:nbn:de:tuda-tuprints-10145

Kurzbeschreibung (Abstract):

Alternatives oder übersetztes Abstract:

Alternatives Abstract

Sprache

The aerobic sulfur oxidation pathway of the thermoacidophilic crenarchaeote Acidianus ambivalens was investigated in the present work. Elemental sulfur or tetrathionate (TT) is oxidized for energy conservation via various intermediates to sulfuric acid by A. ambivalens. In the first step the cytoplasmic sulfur oxygenase reductase (SOR) disproportionates sulfur in an oxygen-dependent reaction to hydrogen sulfide and sulfite with thiosulfate (TS) being formed in a non-enzymic reaction as an additional product. Sulfide-, TS- and TT-oxidizing enzymes from A. ambivalens were analyzed in this work. The membrane-bound thiosulfate:quinone oxidoreductase (TQO)oxidized TS with TT as product and decyl ubiquinone (DQ) or ferricyanide as electron acceptors. The specific activity with DQ was 2,4 ± 0,08 U/(mg protein) at 80°C and with ferricyanide maximally 73 U/(mg protein) at 92°C and pH 6. An activation energy for the reaction with ferricyanide of 37,7 kj/mol was calculated. The Km values were 2.6 mM for TS (kcat = 167/s), 5.87 µM for DQ and 3.4 mM for ferricyanide. The TQO represented the first enzyme of a novel EC class whith the number 1.8.5.2 because of the electron acceptor quinone. A mixture of caldariella quinone, sulfolobus quinone and menaquinone was non-covalently bound to the protein. No other cofactors were detected. An average alpha helix content of 46% and a beta sheet content of 11.6% was calculated for the TQO holoenzyme by circular dichroism spectroscopy. The holoenzyme (102 kDa α2β2-tetramer) was composed of two subunits of apparent molecular masses of 28 and 16 kDa. The larger subunit appeared to be glycosylated and was identical to DoxA, and the smaller was identical to DoxD. Both subunits had been described previously as a part of the terminal quinol:oxygen oxidoreductase complex (cytochrome aa3). Neither doxDA-mRNA by northern-analysis nor TQO activity was found in anaerobic cultivated cells of A. ambivalens. Different homologues of doxDA Genes were identified in other Sulfolobales, in three Bacteroides species and in the sulfur- and iron-oxidizing acidophilic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. A specific tetrathionate hydrolase (TTH) activity of 44 mU/(mg protein) was measured in the soluble fraction of A. ambivalens cells cultivated aerobically with TT. The specific TTH activity was 63-fold lower in sulfur-cultivated cells. TS was one of the products of the TTH reaction. In two different purification procedures the TTH was enriched with a factor of 66 and 89 to specific activities of 2.9 and 3.9 U/(mg protein), respectively. Nevertheless the TTH was still contaminated by other proteins. The Km value was 1.3 mM TT, the apparent Vmax 55 mU, the pH-Optimum 1 and the optimal temperature higher than 95°C. An activation energy of 29 kJ/mol was calculated for the TTH reaction. PQQ (pyrroloquinoline-quinone) increased the TTH activity about the 3-fold. Consequently PQQ could be a cofactor of TTH. The specific TTH activity was 27-fold higher after separation of A. ambivalens spheroplasts compared to total cell extracts. Thus the TTH is probably an extracellular enzyme. A specific sulfide-oxidizing activity of 0.32 U/(mg Protein) with DQ as electron acceptor (SQO) was found in the membrane but not in the soluble fraction of aerobic with sulfur cultivated A. ambivalens cells. The SQO was enriched chromatographically with a factor of 9 to a specific activity of 4.9 U/(mg protein). However the enzyme preparation was not pure and contained contaminations of other proteins. Activity measurements with an oxygen monitor showed a TS- respectively Sulfide-dependent and cyanide-sensitive oxygen consumption by the intact membrane fractions of A. ambivalens. The specific activity was 6.8 respectively 52 ± 5 nmol O2/(min mg total protein). The Sulfide-dependent oxygen consumption followed Michaelis-Menten kinetics with a Km of 0.13 mM Na2S and a Vmax of 72.5 nmol O2/(min mg Protein). It was inhibited by quinone analogous like HQNO (Heptylhydroxyquinoline-N-oxide) and Stigmatellin. An electron transport from TS and Sulfide to oxygen is thus catalysed by the membranes of A. ambivalens. In consequence the first known entry points for electrons from sulfur compound oxidation into the electron transport chain of A. ambivalens were identified in this work.

Englisch

Freie Schlagworte:

aerob, Schwefel, Acidianus ambivalens

Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC):

500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften

Fachbereich(e)/-gebiet(e):

10 Fachbereich Biologie

Hinterlegungsdatum:

17 Okt 2008 09:23

Letzte Änderung:

05 Mär 2013 09:27

PPN: