Fricke, Andreas (2008)
Untersuchungen zur Chromatinstruktur und DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur in menschlichen Zellen mittels ionisierender Strahlung.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

In den letzten Jahren ist immer klarer geworden, dass in eukaryontischen Zellen die Genregulierung entscheidend von einer tertiären DNA-Struktur beeinflusst wird. Andere Hinweise deuten darauf hin, dass diese tertiäre Struktur ebenfalls einen Einfluss auf die Reparatur verschiedenster DNA-Schäden ausübt. Über die tertiäre Chromatinstruktur ist im Gegensatz zum primären und sekundären Level noch nicht sehr viel bekannt. Für ein volles Verständnis der Chromatinorganisation und deren funktionelle Bedeutung für die Genregulation ist es daher essentiell mehr über den Mechanismus und die Dynamik des Auf- und Abbaus dieser Struktur, sowie über deren 3D Arrangement zu erfahren. Neben der Limitierung der anwendbaren Methoden der Strukturaufklärung durch die Verwendung lebender Zellsysteme kommt erschwerend hinzu, dass die DNA auch einer intragenomischen Varianz oder einem Wandel durch den Zellzyklus unterliegen könnte. In der hier vorgestellten Arbeit wird als Lösung ein Konzept verwendet, dass auf der räumlichen Energiedeposition dicht ionisierender Strahlung beruht. So führt eine Bestrahlung mit hoch-LET Teilchen zu einer korrelierten Induktion von komplexen DNA-Doppelstrangbrüchen entlang der Teilchenbahn. Die resultierenden Fragmentverteilungen werden dabei nicht nur von den physikalischen Eigenschaften der Strahlungen beeinflusst, sondern auch durch die 3D-Organisation der DNA. So werden Stellen der DNA, die sich durch deren Struktur in enger räumlicher Nähe befinden, häufiger einen simultanen Schaden erhalten, als Stellen, welche sich räumlich weit voneinander entfernt befinden. Um den Einfluss der verschiedenen Strahlungen und der höher-geordneten Chromatinstruktur auf die Generierung doppelsträngiger DNA-Fragmente zu untersuchen, wurde ein Assay basierend auf einer Pulsfeldgelelektrophorese und anschließender Southern-Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNA-Sonden entwickelt. Die erhaltenen Fragment-Verteilungen als Funktion der Wanderungsstrecke wurden für mehrere Fluenzen unterschiedlichster Strahlungen analysiert. Die Verteilungen zeigten, dass sich nach einer Bestrahlung mit hoch-LET Teilchen zwei deutlich sichtbare Maxima herausbilden. Die Anwesenheit zweier Maxima unterstützt wiederum die Annahme, dass die gemessen Verteilung eine Summe aus zwei verschiedenen Fragmentklassen widerspiegelt. Die erste Klasse, die inter-Track Fragmente, werden durch zwei Teilchenbahnen generiert. Eine Erhöhung der Fluenz führt zu einer Verschiebung des Maximums dieser Fragmente zu kleinerem Molekulargewicht. Diese Fragmentklasse enthält keinerlei biologisch strukturelle Informationen. Die zweite Klasse, die intra-Track Fragmente, werden nur durch ein einziges Teilchen erzeugt. Das Maximum dieser intra-Track Fragmente verschiebt sich mit Zunahme der Fluenz nicht. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass dieses Maximum nahezu unabhängig von der eingesetzten Strahlenart ist und gegen ein Molekulargewicht von circa 500 kbp konvergiert. Da dieses Maximum der intra-Track Fragment unabhängig von physikalischen Parametern ist, kann es eine Größenordnung der höher-geordneten Chromatinstruktur aufzeigen.

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