Rosenberg Lipinsky, H. Henrik von (2006)
Funktionelle Rolle von Oberflächenladungen in der Turret-Domäne des viralen Miniatur-Kaliumkanals Kcv.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Der Kaliumkanal Kcv aus dem Paramecium bursaria Chlorella Virus-1 (PBCV-1) ist einer der kleinsten funktionellen Kaliumkanäle und deshalb als Minimalmodell für die Aufklärung von Struktur-Funktions-Beziehungen besonders geeignet. Die vorliegende Arbeit ist auf funktionelle Eigenschaften von extrazellulären Oberflächenladungen fokussiert. Einem hoch konservierten Motiv von geladenen Aminosäuren in der Turret-Domäne (Asp,Lys,Lys/DKK-Motiv) kommt dabei eine zentrale Rolle zu. Während alle funktionellen Mutanten des DKK-Motivs in den Basisfunktionen des Kanals, wie Pharmakologie und Ionen-Selektivität, im Vergleich zum Wildtyp keine wesentlichen Unterschiede aufweisen, zeigten alle Mutanten eine signifikant herabgesetzte Leitfähigkeit, die im Zusammenhang mit einer reduzierten Einzelkanalleitfähigkeit diskutiert wird. Ein weiteres beobachtetes Phänomen, ist eine Verschiebung der spannungsabhängigen Eigenschaften (Aktivierungsspannung) aller Mutanten, bei denen eine oder mehrere Oberflächenladungen neutralisiert wurden. Im Extremfall führt dies zur Umkehrung der Spannungsabhängigkeit. Außerdem konnte in Bezug auf die Kinetik der Lysin-Mutanten innerhalb des DKK-Motivs eine Inaktivierung statt einer Aktivierung im biphasischen Verlauf der trägen spannungsabhängigen Komponente festgestellt werden. Alle neutralisierten Mutanten, aber auch eine ladungskonservative Mutante (K46R), weisen dieses Phänomen auf. Die veränderte Kinetik wird nicht mit einer veränderten Nettoladung, sondern mit mutationsbedingten Konformationsänderungen in Verbindung gebracht. Die experimentellen Daten führen zu dem Schluss, dass die Ladungen in der Turret-Domäne nicht essentiell für die generelle Funktion des Kanals sind und keinen Einfluss auf den Permeationsweg des Ions durch den Selektivitätsfilter haben. Die exakte sterische Beschaffenheit der Aminosäuren in der Turret-Domäne ist jedoch für funktionelle Parameter von Bedeutung. Ein um die extrazelluläre Pore gelegener negativ geladener Ring, bestehend aus Aspartat (D) ist ein weiterer Untersuchungsaspekt dieser Arbeit. Anhand von isosterischer Neutralisation mit Asparagin (N), konnten Kanaleigenschaften von Kcv grundlegend beeinflusst werden. Die hohe Kaliumselektivität und die Blockierbarkeit durch Barium gehen verloren. Zudem tendiert die Strom-Spannungs-Beziehung, mit einer typischen Abnahme an Leitfähigkeit bei negativen Spannungen, zu einem annähernd Ohmschen-Kanal mit nahezu linearer Strom-Spannungs-Beziehung. Folglich ist durch diese Mutation die Geometrie des Selektivitätsfilters, einschließlich der Barium-Bindungsstelle im Filter, grundsätzlich verändert. Theoretische Analysen zur Elektrostatik und Kaliumdichteverteilung geben Anlass zu der Annahme, dass der negativ geladene Ring um die Pore, im Zusammenspiel mit dem DKK-Motiv, „Ionenbahnen“ auf der Oberfläche des Kanals ausbilden und so die Akkumulation von Kalium vor der Pore einerseits und die Nachlieferung des Substrats aus der Peripherie des Kanals andererseits gewährleistet. Die Ergebnisse der theoretischen Untersuchungen erlauben, tolerierte und nicht tolerierte Mutationen als Kaliumdichte-erhaltende bzw. nicht erhaltende Störungen aufzufassen. Es fällt auf, dass die Kcv-Sequenz und der resultierende Proteinaufbau offenbar in der Lage sind, lokale Fluktuationen der elektrostatischen Verhältnisse zu kompensieren, um einen ungestörten Kationentransport zu ermöglichen. Die vorliegende Arbeit verschafft einen Einblick in die elektrophysiologische Relevanz der Turret-Domäne bzw. von Oberflächenladungen für den Kaliumkanal Kcv und bietet eine modellbasierte Vorstellung zur Erklärung der auftretenden Phänomene.

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