Sartorius-Neef, Simone (2005)
Untersuchungen zur Initiation der Translation in halophilen Archaea.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung
Kurzbeschreibung (Abstract)
In dieser Arbeit wurde die Initiation der Translation in halophilen Archaea untersucht, dazu wurden verschiedene Gene der gasvesikel-codierenden Region aus Hb. salinarum PHH1 verwendet. Für die Analyse der Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz) wurde das p-gvpH-Gen verwendet. Dieses besitzt 7 nt stromaufwärts des Startcodons eine mögliche SD-Sequenz, die mit 7 nt mit der am 3′-Ende des 16S rRNA gelegenen Anti-SD-Sequenz übereinstimmt. Als Reporter diente dabei das GvpH-Protein bzw. BgaH, ein halobakterielles Enzym mit ß-Galaktosidase-Aktivität. Die Untersuchungen zeigten, dass eine vollständig mutierte SD-Sequenz zu weniger Produkt führte, als wenn die SD-Sequenz vorhanden war. Eine 4 nt scanning-Mutagenese des 5′untranslatierten Bereichs (5′-UTR) des gvpH-Gens zeigte, dass diese 7 nt-lange Sequenz wichtig aber nicht zwingend erforderlich für die Initiation der Translation ist. Der 5′-Bereich des SD-Elements (GGAGG) stellt das Kernmotiv dar, da Mutationen in diesem Bereich die Translation stärker negativ beeinflussten als Mutationen im 3′-Bereich. Die vollständige Mutation der SD-Sequenz führte zu einer stark reduzierten BgaH-Aktivität, aber nicht zum vollständigen Verlust, was zeigt, dass das SD-Element nicht essentiell für eine erfolgreiche Translation ist. Veränderungen des 7 nt langen Abstandes zwischen der SD-Sequenz und dem Startcodon zeigten, dass der Abstand 4 oder 10 nt betragen kann, ein Abstand von nur 1 nt allerdings zu gering ist und letztlich die Translation verhindert. Als Beispiel für eine mRNA, die in ihrem mRNA leader keine SD-Sequenz besitzt, wurde das p-gvpA-Gen verwendet. p-gvpA besitzt eine 20 nt langen leader, der nicht translatiert wird. Mittels der scanning-Mutagenese konnte hier kein Bereich bestimmt werden, der die Translation besonders beeinflusst. Eine Verkürzung des leaders von 20 auf 14 nt führte zu einer um das 40fach erhöhten BgaH-Aktivität, eine vollständige Deletion zu einer 100fachen Erhöhung. Der mRNA-leader könnte deshalb an der negativen Regulation der Translation beteiligt sein. Es wurde daher auch der mRNA-leader des p-gvpD- und p-gvpF-Gens untersucht. Dabei zeigte sich, dass jeweils das leader-lose Transkript stärker translatiert wurde als das leader-enthaltende Transkript. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde ein Vektor zur Überexpression des p-gvpE-Gens konstruiert. Dazu wurde die PA-Promotorregion mit dem Transkriptionsstart direkt an den p-gvpE-Leserahmen fusioniert. Im SDS-PAGE zeigte sich eine starke Überexpression von p-gvpE, dass anschließend proteinchemisch aufgereinigt werden soll.
| Typ des Eintrags: |
Dissertation
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| Erschienen: |
2005 |
| Autor(en): |
Sartorius-Neef, Simone |
| Art des Eintrags: |
Erstveröffentlichung |
| Titel: |
Untersuchungen zur Initiation der Translation in halophilen Archaea |
| Sprache: |
Deutsch |
| Referenten: |
Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas ; Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn |
| Berater: |
Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas |
| Publikationsjahr: |
9 Mai 2005 |
| Ort: |
Darmstadt |
| Verlag: |
Technische Universität |
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Datum der mündlichen Prüfung: |
25 Januar 2005 |
| URL / URN: |
urn:nbn:de:tuda-tuprints-5557 |
| Kurzbeschreibung (Abstract): |
In dieser Arbeit wurde die Initiation der Translation in halophilen Archaea untersucht, dazu wurden verschiedene Gene der gasvesikel-codierenden Region aus Hb. salinarum PHH1 verwendet. Für die Analyse der Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz) wurde das p-gvpH-Gen verwendet. Dieses besitzt 7 nt stromaufwärts des Startcodons eine mögliche SD-Sequenz, die mit 7 nt mit der am 3′-Ende des 16S rRNA gelegenen Anti-SD-Sequenz übereinstimmt. Als Reporter diente dabei das GvpH-Protein bzw. BgaH, ein halobakterielles Enzym mit ß-Galaktosidase-Aktivität. Die Untersuchungen zeigten, dass eine vollständig mutierte SD-Sequenz zu weniger Produkt führte, als wenn die SD-Sequenz vorhanden war. Eine 4 nt scanning-Mutagenese des 5′untranslatierten Bereichs (5′-UTR) des gvpH-Gens zeigte, dass diese 7 nt-lange Sequenz wichtig aber nicht zwingend erforderlich für die Initiation der Translation ist. Der 5′-Bereich des SD-Elements (GGAGG) stellt das Kernmotiv dar, da Mutationen in diesem Bereich die Translation stärker negativ beeinflussten als Mutationen im 3′-Bereich. Die vollständige Mutation der SD-Sequenz führte zu einer stark reduzierten BgaH-Aktivität, aber nicht zum vollständigen Verlust, was zeigt, dass das SD-Element nicht essentiell für eine erfolgreiche Translation ist. Veränderungen des 7 nt langen Abstandes zwischen der SD-Sequenz und dem Startcodon zeigten, dass der Abstand 4 oder 10 nt betragen kann, ein Abstand von nur 1 nt allerdings zu gering ist und letztlich die Translation verhindert. Als Beispiel für eine mRNA, die in ihrem mRNA leader keine SD-Sequenz besitzt, wurde das p-gvpA-Gen verwendet. p-gvpA besitzt eine 20 nt langen leader, der nicht translatiert wird. Mittels der scanning-Mutagenese konnte hier kein Bereich bestimmt werden, der die Translation besonders beeinflusst. Eine Verkürzung des leaders von 20 auf 14 nt führte zu einer um das 40fach erhöhten BgaH-Aktivität, eine vollständige Deletion zu einer 100fachen Erhöhung. Der mRNA-leader könnte deshalb an der negativen Regulation der Translation beteiligt sein. Es wurde daher auch der mRNA-leader des p-gvpD- und p-gvpF-Gens untersucht. Dabei zeigte sich, dass jeweils das leader-lose Transkript stärker translatiert wurde als das leader-enthaltende Transkript. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde ein Vektor zur Überexpression des p-gvpE-Gens konstruiert. Dazu wurde die PA-Promotorregion mit dem Transkriptionsstart direkt an den p-gvpE-Leserahmen fusioniert. Im SDS-PAGE zeigte sich eine starke Überexpression von p-gvpE, dass anschließend proteinchemisch aufgereinigt werden soll. |
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Alternatives oder übersetztes Abstract: |
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Alternatives Abstract | Sprache |
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The initiation of translation was investigated in halophilic archaea using different genes enconding gas vesicles of Hb. salinarum PHH1. The p-gvpH gene was used for investigation of a putative Shine and Dalgarno sequence (SD sequence). This gene contains 7 nt upstream of the start codon a putative SD sequence, which is with 7 nt complementary to an 8 nt sequence found near the 3′-end of the 16S rRNA. The GvpH protein or BgaH, a halobacterial enzyme with ß-galactosidase activity were used as reporters. The investigations indicated that a complete mutation of the SD sequence resulted in less amounts of product compared to the leader sequence containing an SD sequence. A 4 nt scanning mutagenesis of the 5′-UTR of the gvpH gene pointed out, that the sequence 7 nt uptream of the start codon functions as SD element, but is not required for an initiation of translation. The 5′-region of the SD element appeared to be the core motif, since mutations in that region had a stronger influence on translation compared to mutations in the 3′-region of the SD element. A complete mutation of the SD element resulted in a reduced BgaH activity, but not in a complete loss. Varying the distance between the SD sequence and the start codon indicated that the distance can be 4 or 10 nt, whereas a distance of only 1 nt was to short and prevented translation. The p-gvpA gene containing a 20 nt long leader region was used as an example for an mRNA lacking an SD element. The scanning mutagenesis indicated no specific region of special importance for translation. A shortening of the leader from 20 to 14 nt resulted in a 40-fold enhanced BgaH activity, whereas the complete deletion of the leader resulted in a 100-fold increase. Further analyses on the p-gvpD and p-gvpF mRNA leaders demonstrated that a deletion of the leader always resulted in enhanced BgaH activities compared to the activity derived from the respective mRNA containing the mRNA leader. A vector for the overexpression of the p-gvpE gene was constructed. Therefore the PA promotor was directly fused to the p-gvpE open reading frame. The SDS-PAGE indicated an enhanced expression of p-gvpE that now should be purified. | Englisch |
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| Freie Schlagworte: |
Halobakterium salinarum, Initiation der Translation, SD-Sequenz, Shine-Dalgarno-Sequenz, Gasvesikel, vac-Region, mRNA-Stabilität, mRNA-rRNA Wechselwirkung, leader-lose mRNA |
| Schlagworte: |
| Einzelne Schlagworte | Sprache |
|---|
| Halobacterium salinarum, translation initiation, Shine and Dalgarno sequence, SD sequence, gene regulation, mRNA stability, leaderless mRNA, mRNA-rRNA interaction, gas vesicles, vac-region | Englisch |
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| Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): |
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Fachbereich(e)/-gebiet(e): |
10 Fachbereich Biologie |
| Hinterlegungsdatum: |
17 Okt 2008 09:22 |
| Letzte Änderung: |
30 Jul 2017 21:18 |
| PPN: |
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| Referenten: |
Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas ; Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn |
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Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: |
25 Januar 2005 |
| Schlagworte: |
| Einzelne Schlagworte | Sprache |
|---|
| Halobacterium salinarum, translation initiation, Shine and Dalgarno sequence, SD sequence, gene regulation, mRNA stability, leaderless mRNA, mRNA-rRNA interaction, gas vesicles, vac-region | Englisch |
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