Volz, Frank (2004)
Molekularbiologische und physiologische Untersuchungen zum Phosphattransport bei Geosiphon pyriformis.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Phosphat als ein für die Pflanzen essentielles Element wird von diesen in den meisten Fällen über symbiotische Mykorrhizapilze aufgenommen, die an bzw. in den Wurzeln von ca. 80 - 90 % aller Landpflanzen (SMITH & READ, 1997) leben. Das Untersuchungsobjekt der vorliegenden Arbeit, Geosiphon pyriformis, stellt insofern eine Besonderheit dar, als es einerseits als ein ursprünglicher Vertreter der arbuskulären Mykorrhizapilze (AM-Pilze) einzustufen ist (u. a. SCHÜßLER ET AL., 2001; SCHWARZOTT ET AL., 2001), andererseits aber eine Endosymbiose mit dem Cyanobakterium Nostoc punctiforme eingeht. Geosiphon pyriformis kann aus verschiedenen Gründen als Modellsystem für die AM angesehen werden, vor dem Hintergrund der speziellen Anpassung der Symbiose Geosiphon pyriformis an Phosphat-Mangelbedingungen sollten die molekularen und physiologischen Mechanismen der Aufnahme von Phosphat und ggf. anderer Nährstoffe untersucht und mit denen der AM-Pilze verglichen werden. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnte aus Geosiphon pyriformis eine genomische DNA-Genbank aufgebaut und so eine von den schwierigen Kulturen der Symbiose unabhängige Grundlage für die Bearbeitung weiterer molekularbiologischer Fragestellungen gelegt werden. Aus dieser Genbank konnten sowohl ein 340 bp langes Teilfragment eines Gens für einen high-affinity Phosphattransporter, als auch ein 463 bp langes Teilfragment eines bakteriellen Gens für einen ABC-Typ-Hexosetransporter amplifiziert und charakterisiert werden. Die weitere Analyse des Phosphattransporter-Genfragments im Vergleich zu anderen pilzlichen und pflanzlichen Phosphattransportergenen zeigte, dass die Divergenz der Gensequenzen innerhalb des Reiches der Pilze deutlich größer war als zwischen Pflanzen. So waren die berechneten genetischen Distanzen von pilzlichen Genen, deren Genprodukten die gleichen Funktionen und ähnliche Substratspezifität zugeschrieben werden, erheblich größer als die Distanzen zwischen pflanzlichen Genen aus einer Art, deren Genprodukte deutlich unterschiedliche Substratspezifität aufweisen. Erstmals konnte innerhalb eines genomischen DNA-Fragments eines pilzlichen Phosphattransportergens eine mögliche Intronsequenz charakterisiert werden. Das hier charakterisierte bakterielle Zuckertransporter-Genfragment konnte im Rahmen einer innerhalb dieser Dissertation angeleiteten Diplomarbeit den in Sporen und Hyphen von AM-Pilzen lebenden „bacteria-like organisms“ (BLOs) von Geosiphon pyriformis zugeordnet werden. Die zu diesem Zweck zusätzlich durchgeführte Analyse der 16 S-rRNA-Gene führte zu grundlegenden Hinweisen über die taxonomische Stellung der BLOs von Geosiphon pyriformis innerhalb des Reichs Bacteria. Zur weiteren Analyse des Phosphatmetabolismus der Symbiose Geosiphon pyriformis wurden 32Pi-Tracerexperimente durchgeführt und diskutiert, die zur Etablierung der Methode und ersten Aussagen bezüglich der unterschiedlichen Stoffwechselreaktionen der Symbiose und der Symbiosepartner in Abhängigkeit von den Versuchsbedingungen führten. So ist eine hohe Substrataffinität des Pi-Aufnahmesystems von Geosiphon pyriformis wahrscheinlich, da die Aufnahme des Tracers aus einer Lösung mit extrem niedrigem Phosphatgehalt (max. 5,4 nM) nachgewiesen werden konnte. Die übrigen Experimente wurden bei einem Gesamtphosphatgehalt von 10 µM durchgeführt. Insbesondere die Pulse-Chase-Experimente zeigten erhebliche Unterschiede zwischen Blasen von Geosiphon pyriformis und freilebenden Zellen des Endosymbionten Nostoc punctiforme auf. So erfolgte die Weitergabe des Tracers aus dem Pi-Pool der Blasen erheblich schneller und an eine größere Zahl von Metaboliten. Im Vergleich der Applikation des Tracers im Licht bzw. im Dunkeln bei Geosiphon-Blasen zeigten sich deutlich höhere Markierungen bei Produkten des Calvin-Zyklus im Licht, die auf die photosynthetisch aktiven endosymbiontischen Nostoc-Zellen zurückgeführt werden konnten. Bei der genauen Bestimmung der Substrataffinität sowie anderer Kenngrößen des Phosphatstoffwechsels blieben allerdings noch viele Fragen offen. Insbesondere scheiterten wiederholt Versuche am mangelnden Versuchsmaterial, da die Kultur der Symbiose Geosiphon pyriformis sich nach wie vor als äußerst schwierig erwies.

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