Oppolzer, Thomas H. (2004)
Analyse des Oberflächenproteoms von Hirnkapillarendothelzellen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung

Kurzbeschreibung (Abstract)

Das Vertebratengehirn stellt das am höchsten spezialisierte bekannte Organ dar. In seiner Funktion ist es extrem abhängig von einem konstanten physiologischen Milieu. Die Stabilität eines solchen Milieus, die Homöostase, ist vor allem zum Schutz des neuronalen Gewebes erforderlich. Zum einen muss die Versorgung des Gehirns mit Nährstoffen und Sauerstoff garantiert werden, andererseits muss das neuronale Gewebe vor potentiell im Blut gelösten Giftstoffen geschützt werden. Diese komplexe Schutz- und Versorgungsfunktion wird durch das kapilläre System des Gehirns wahrgenommen. Dessen mikrovaskuläres Endothel wird aufgrund seiner Schrankenfunktion als Blut-Hirn-Schranke (BHS) bezeichnet. Das Proteom der Hirnkapillarendothelzelle (BMEC) bedingt deren spezifische Eigenschaften und somit direkt die Selektivität der Blut-Hirn-Schranke. Die BHS ist vor allem aus pharmakologischer und medizinischer Sicht von Bedeutung. Spezielles Interesse gilt dabei der luminalen Plasmamembran der mikrovaskulären Hirnkapillarendothelzellen. Diese Membran stellt für im Blut gelöste Substanzen die erste Barriere bei der Passage der BHS dar. Die Proteine dieser Zellmembran sind maßgeblich beteiligt an zellulärer Kommunikation, an Transportprozessen und an der Ausbildung der tight junctions. Die Charakterisierung des Oberflächenproteoms der BMEC verspricht ein besseres Verständnis der Schrankenfunktion und könnte Wege zu deren pharmakologischen Modulation aufzeigen. In der vorliegenden Arbeit wurde das Oberflächenproteom von BMEC analysiert. Hierzu wurde ein neuartiges Reagenz entwickelt, das die selektive Markierung der Oberflächenproteine lebender Zellen und die schonende Anreicherung ihrer Membranproteine ermöglichte. Die hierfür synthetisierte SNHS-ImBAS (Sulfo-NHS-Iminobiotinylaminocapronsäure) zeigte deutliche Vorteile gegenüber konventionellen Biotinylierungsreagenzien, sowohl auf der Ebene der Probenvorbereitung, als auch auf der Ebene der MALDI-MS-Analytik. Dieses zum Patent angemeldete Reagenz erwies sich in den durchgeführten Arbeiten als nicht cytotoxisch und als nicht membrangängig. Um es zur Analyse des Oberflächenproteoms vitaler BMEC einsetzen zu können, wurde dieser Zelltyp aus dem hochkomplexen Organ Gehirn isoliert und kultiviert. Die Kontrolle der Zellmaterials erfolgte mittels immunchemischer Nachweise von Markerproteinen. Nach einer präparativen Oberflächenmarkierung von BMEC wurden die Membranproteine angereichert und im SDS-Gel getrennt. Mittels eigens etablierter Affinitätsfärbungen konnten die selektiven Eigenschaften des Reagenzes und die erfolgreiche Anreicherung markierter Proteine belegt werden. Die Identifizierung der angereicherten Proteine erfolgte mittels MALDI-Massenspektrometrie und anschließender Datenbank-Recherche. Hierbei wurden insgesamt 45 Proteine identifiziert. Für die Hälfte dieser Proteine war eine Lokalisation an der Zelloberfläche beschrieben. Die Funktion und Lokalisation bei einem weiteren Viertel der Proteine waren unbekannt. Für die restlichen Proteine war eine intrazelluläre Lokalisation beschrieben. Die Expression von vier der identifizierten Proteine mit bekannter Funktion wurde mit ergänzenden Methoden in BMEC bestätigt. Hierbei handelte es sich um den Rezeptor Plexin B1, die sekretierte Protease MMP10 und die Transportproteine MRP2 (ABCC2) und ATP7b. Der zuletzt aufgeführte Kupfer-Transporter ATP7b konnte in verschiedenen Isoformen nachgewiesen werden, die sich von den humanen Sequenzen zum Teil deutlich unterschieden. Damit wurde mit der Entwicklung und dem Einsatz eines neuen, zum Patent angemeldeten Reagenzes ein Beitrag zur Aufklärung der Blut-Hirn-Schranke geleistet.

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