Die FK506-bindenden Proteine FKBP12, FKBP51 und FKBP52 sind Peptidyl-Prolyl Isomerasen und am besten dafür bekannt, dass sie den Wirkmechanismus der natürlichen molekularen Kleber FK506 und Rapamycin ermöglichen. Innerhalb der FKBP-Familie fungieren die großen Proteine FKBP51 und FKBP52 als Cochaperone in der Hsp90-Maschinerie und als Schlüsselregulatoren des Glucocorticoid Rezeptor Signalwegs. Dabei hemmt FKBP51 die GR-Aktivität und FKBP52 aktiviert diese.

Um die Entwicklung von FKBP-basierten Liganden zu unterstützen, habe ich zunächst verschiedene Testsysteme etabliert, um Aufschluss über biochemische und molekularbiologische Schlüsselaspekte von FKBPs zu ermöglichen. (i) Ich habe einen HTRF-Bindungstest für FKBP-Liganden entwickelt, der eine präzise Messung der Bindungsaffinität von ultra-hoch affinen FKBP-Liganden möglich macht. (ii) Anschließend wurde ein NanoBRET-Testsystem zur Charakterisierung von FKBP-Liganden in lebenden Zellen entwickelt, optimiert und semi-automatisiert. Dieses Testsystem ermöglicht eine schnelle Charakterisierung der intrazellulären Bindung von FKBP-Liganden und FKBPs. (iii) Des Weiteren habe ich zur Untersuchung der Schlüsselfunktionen von FKBP51 und FKBP52 im GR-Signalweg ein GR Aktivität Reportergen-Testsystem etabliert. (iv) Um den Abbau von FKBPs zu untersuchen, entwickelte ich darüber hinaus eGFP-fusionsbasierte Reportersysteme zur Bestimmung von zellulären FKBP12- und FKBP51-Spiegeln, sowie einen HTRF-basiertes Reportersystem für die FKBP52-Mengen.

Die Affinität von Liganden ist ein Schlüsselparameter für deren Wirksamkeit. Der HTRF-Bindungstest zeigte, dass FKBP-Liganden biochemisch mit picomolarer Affinität an FKBPs binden. Jedoch ist für die Wirksamkeit von Liganden in einem zellulären Umfeld die intrazelluläre Zielproteinbindung entscheidend. Mit dem NanoBRET-Testsystem konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass FKBP-Liganden menschliche FKBPs in lebenden Zellen binden. Dabei wurde jedoch eine systematische Diskrepanz zwischen der biochemischen Bindungsstärke und der zellulären Zielproteinbindung deutlich. Darüber hinaus zeigten die Ergebnisse, dass makrocyclische Liganden in ihrer zellulären Potenz gegenüber linearen Liganden der SAFit-Klasse (bei gleichen biochemischen Affinitäten) überlegen sind. Das NanoBRET-Testsystem schließt die Lücke zwischen biochemischer Bindung und zellulären Effekten und wird die Ligandenoptimierung in Richtung zellulärer Potenz weisen. FKBP51 ist im zellulären Kontext ein hemmender Schlüsselregulator des Glucocorticoid Rezeptor Signalwegs, der das funktionelle Bindeglied zu Stress-bedingten Störungen darstellt. Mit dem GR Aktivität Reportergen-Testsystem konnte ich zeigen, dass die synthetischen Liganden SAFit2 und 18(S Me) den GR Signalweg nicht reaktivierten und keine funktionellen Effekte zeigten, obwohl das NanoBRET-Testsystem zeigte, dass diese die FK506-Bindetasche blockieren. Dies zeigt, dass FKBP51 den Glucocorticoid Rezeptor durch Gerüstfunktionen reguliert und die Bindetasche dabei entbehrlich ist. Jedoch reaktivierte der immunsuppressive Naturstoff FK506, welcher viel weiter aus der Bindetasche hervorsteht, den Glucocorticoid Rezeptor Signalweg. Dies zeigte, dass FK506, aber nicht kleinere Liganden, regulatorische FKBP51:GR-Kontakte aufheben können.

Die Reportergen-Testsysteme zeigen, dass die Gerüstfunktionen von FKBP51 nicht durch synthetische, kleine Liganden aufgehoben werden können. Jedoch können diese Liganden, die eine nicht funktionelle Bindetasche adressieren, zur Entwicklung von PROTACs genutzt werden. PROTACs degradieren das Protein und blockieren damit alle Proteinfunktionen. Da die Entwicklung von PROTACs für FKBP51 deutlich herausfordernder war als erwartet, musste eine große Anzahl an PROTAC-Kandidaten getestet werden. Um 220 FKBP-fokussierte PROTAC-Kandidaten bezüglich des Abbaus der relevantesten FKBPs zu testen, habe ich eGFP-fusionsbasierte Proteinmengen-Reportersysteme für FKBP12 und FKBP51, sowie einen HTRF-basiertes Proteinmengen-Reportersystem für FKBP52 etabliert. Überraschenderweise hatten die PROTAC-Kandidaten eine starke Degradationspräferenz für FKBP12 gegenüber den ähnlichen Homologen FKBP51 und FKBP52. Von den Kandidaten war dabei eine Großzahl aktiv für FKBP12, sechs für FKBP51 und keiner für FKBP52. Eine sich anschließende Analyse von FKBP12-FKBP51FK1 Tauschmutanten zeigte, dass die FK2- und TPR-Domäne die Abbaubarkeit negativ beeinflussen. Die Linker-basierte Optimierung eines PROTACs der ersten Generation mit begrenzter Selektivität konnte jedoch die negative Abbaupräferenz für FKBP51 überwinden und führte zu dem potenten FKBP51 PROTAC SelDeg51 mit verbesserter zellulärer Aktivität und Selektivität. SelDeg51 baut FKBP51 auf effiziente Weise ab und ist die beste Substanz ihrer Art. Durch Bestätigung des Wirkmechanismus und eine gründliche zelluläre Charakterisierung habe ich SelDeg51 als nützliches funktionelles Werkzeug etabliert. Anschließend konnte ich in einem Reportergen-Testsysteme zeigen, dass der Abbau von FKBP51, aber nicht die Inhibition, den GR-Signalweg auf potente Weise reaktivierte. Dieses Ergebnis demonstriert eine fundamental neuartige Pharmakologie mit höherer Wirksamkeit gegenüber kleinen funktionell inaktiven synthetischen Liganden.

Die Natur hat wiederholt auf FKBP12 als Adapterprotein zurückgegriffen, um die Wirksamkeit von molekularen Klebern zu ermöglichen. Zusammen mit der hohen Abbaubarkeit von FKBP12 deutet dies an, dass FKBP12 ein ideales Modellsystem für die Entdeckung von Proteinabbau induzierenden molekularen Klebern sein könnte. In geeigneten Fällen können Liganden molekulare Kleber sein, die zusätzlichen Funktionen besitzen. Ich habe in dieser Studie das eGFP-fusionsbasierte Proteinmengen-Reportersystem für FKBP12, genutzt um durch zelluläre Tests aus über 900 hauseigenen FKBP-Liganden Proteinabbau-induzierende molekulare Kleber für FKBP12_eGFP zu identifizieren. Aus der Struktur-Aktivitätsbeziehung der primären Treffer sowie aus der Struktur von inaktiven Analoga konnte eine rationale Strategie zur Optimierung des vielversprechenden Treffers abgeleitet werden. Die Optimierung führte zur Synthese der Substanz PPu670, welche doppelt so effektiv wie das Ausgangsmolekül war. Anschließende zelluläre Tests zeigten einen FK506-Bindestelle- und Proteasom-abhängigen, aber Neddylierungs-unabhängigen Wirkmechanismus. Letztendlich identifizierte eine CRISPR-basierte Genom-weite Funktionsverlustanalyse die E3 Ligase UBR3 als relevantes Zielprotein. Meine Studie demonstriert, dass Zielprotein-fokussierte Substanzbibliotheken abbauende molekulare Kleber enthalten können und dass sich diese durch zelluläre Testsysteme identifizieren lassen.

Zusammengefasst werden die von mir entwickelten Testsysteme wegweisend in der künftigen Entwicklung von FKBP-Liganden sein. SelDeg51 kann genutzt werden, um alle Proteinfunktionen zu blockieren und um die Frage zu beantworten, ob zelluläre FKBP51-Mengen in einem bestimmten Kontext wichtig sind. Darüber hinaus zeigt meine Arbeit, dass zelluläre Tests von zielgerichteten Bibliotheken ein fruchtbarer Ansatz sein können, um Protein-abbauende molekulare Kleber zu entdecken.