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Novel regulators of chromatin response to DNA damage

Kolobynina, Ksenia G. (2024)
Novel regulators of chromatin response to DNA damage.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00028085
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

The DNA damage response (DDR) signaling maintains genome stability, thus protecting cells from aging or malignant transformation. DNA damage and following DDR occur in the context of chromatin, and chromatin governs the damage response at multiple levels including post-translational modifications of histone and non-histone proteins. Among these modifications reported at the sites of DNA double-strand breaks (DSBs) are phosphorylation, acetylation, methylation, and ubiquitination. DSB signaling and repair take place in a defined chromatin domain characterized by the enrichment of specific post-translational modifications and accumulated proteins. These structures are microscopically visible and are termed “DNA repair foci". Phosphorylation of serine 139 of histone H2AX (termed γH2AX) is the key event and forms the platform for subsequent repair. The formation and persistence of γH2AX domains reflect chromatin architecture and the efficiency of DSB repair. Another important post-translational modification involved in DSB repair is ubiquitination. Ubiquitination is a covalent protein modification, which requires a three-enzyme cascade. The high abundance of ubiquitin ligases, internal ubiquitin modification sites, and a variety of possible ubiquitin signal structures make ubiquitination one of the most complex modification types in DDR. Due to the complexity large part of the ubiquitin-dependent network remains to be discovered, although several ubiquitin ligases were shown to be involved in the DDR. To identify novel ubiquitin ligases involved in the DDR a human ubiquitinome-wide (663 E3 ubiquitin ligases) high-throughput screening was performed using the formation and persistence of γH2AX foci as a proxy for DSB repair following X-ray exposure. More than 100 novel ubiquitin modifiers that affect DNA damage signaling (30 min post-irradiation) and/or repair (24 h post-irradiation) were identified in the screening. Of the identified hits 62.2% are associated with the damage signaling only (early time point, 107 ubiquitin modifiers), while 15.1 % of the hits are exclusively associated with the late repair point (24 h, 26 ubiquitin modifiers). The remaining 22.7% of the identified target genes affect both repair stages (39 ubiquitin modifiers). Gene ontology analysis and in silico protein-protein interaction analysis identified clusters of physically interacting hits for each time point. This data provided a list of novel chromatin modifiers involved in the DNA damage response and repair and their potential molecular function. In a second screen 33 of the identified hits, which affected both early and late repair time points, were studied in more detail. This screen used more time points and additionally made use of the immunohistochemical detection of RAD51 (homologous recombination) and 53BP1 (non-homologous end joining) foci to gain information about the affected DSB repair pathways. In addition, we performed the cluster analysis and identified four time-independent DNA repair phenotypes represented by CXXC1, XIAP, RNF8 and RNF168 proteins. In the third part of this work, the molecular function of one hit, the PHF19, was studied in the context of the chromatin response to DSBs. PHF19 was shown to be crucial for the γH2AX signaling and formation of the repair focus. PHF19-depleted cells experienced global chromatin decondensation and a significant decrease in γH2AX foci intensity post-X-ray irradiation. Moreover, PHF19 knockdown caused DSB repair delay compared to wild type cells. In accordance with the γH2AX signaling impairment, the lack of the PHF19 protein hindered RAD51, RAD52, 53BP1, pATM and RNF8 recruitment to sites of DSBs. Both general ubiquitination and H2AK119ub specifically were decreased at the sites of breaks. With the use of ubiquitin binder probes, we showed that ubiquitination is reduced at the sites of the damage in living PHF19 knockdown cells. Additionally, we showed that PHF19 association with the DSB site reaches its maximum one hour post-irradiation. In conclusion, these findings provide previously unknown ubiquitin-dependent signaling cascades in the DDR and underline the role of chromatin ubiquitination in DSB repair suggesting possible targets for anti-cancer therapy.

Typ des Eintrags: Dissertation
Erschienen: 2024
Autor(en): Kolobynina, Ksenia G.
Art des Eintrags: Erstveröffentlichung
Titel: Novel regulators of chromatin response to DNA damage
Sprache: Englisch
Referenten: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Löbrich, Prof. Dr. Markus
Publikationsjahr: 20 September 2024
Ort: Darmstadt
Kollation: 305 Seiten
Datum der mündlichen Prüfung: 1 Juli 2024
DOI: 10.26083/tuprints-00028085
URL / URN: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/28085
Kurzbeschreibung (Abstract):

The DNA damage response (DDR) signaling maintains genome stability, thus protecting cells from aging or malignant transformation. DNA damage and following DDR occur in the context of chromatin, and chromatin governs the damage response at multiple levels including post-translational modifications of histone and non-histone proteins. Among these modifications reported at the sites of DNA double-strand breaks (DSBs) are phosphorylation, acetylation, methylation, and ubiquitination. DSB signaling and repair take place in a defined chromatin domain characterized by the enrichment of specific post-translational modifications and accumulated proteins. These structures are microscopically visible and are termed “DNA repair foci". Phosphorylation of serine 139 of histone H2AX (termed γH2AX) is the key event and forms the platform for subsequent repair. The formation and persistence of γH2AX domains reflect chromatin architecture and the efficiency of DSB repair. Another important post-translational modification involved in DSB repair is ubiquitination. Ubiquitination is a covalent protein modification, which requires a three-enzyme cascade. The high abundance of ubiquitin ligases, internal ubiquitin modification sites, and a variety of possible ubiquitin signal structures make ubiquitination one of the most complex modification types in DDR. Due to the complexity large part of the ubiquitin-dependent network remains to be discovered, although several ubiquitin ligases were shown to be involved in the DDR. To identify novel ubiquitin ligases involved in the DDR a human ubiquitinome-wide (663 E3 ubiquitin ligases) high-throughput screening was performed using the formation and persistence of γH2AX foci as a proxy for DSB repair following X-ray exposure. More than 100 novel ubiquitin modifiers that affect DNA damage signaling (30 min post-irradiation) and/or repair (24 h post-irradiation) were identified in the screening. Of the identified hits 62.2% are associated with the damage signaling only (early time point, 107 ubiquitin modifiers), while 15.1 % of the hits are exclusively associated with the late repair point (24 h, 26 ubiquitin modifiers). The remaining 22.7% of the identified target genes affect both repair stages (39 ubiquitin modifiers). Gene ontology analysis and in silico protein-protein interaction analysis identified clusters of physically interacting hits for each time point. This data provided a list of novel chromatin modifiers involved in the DNA damage response and repair and their potential molecular function. In a second screen 33 of the identified hits, which affected both early and late repair time points, were studied in more detail. This screen used more time points and additionally made use of the immunohistochemical detection of RAD51 (homologous recombination) and 53BP1 (non-homologous end joining) foci to gain information about the affected DSB repair pathways. In addition, we performed the cluster analysis and identified four time-independent DNA repair phenotypes represented by CXXC1, XIAP, RNF8 and RNF168 proteins. In the third part of this work, the molecular function of one hit, the PHF19, was studied in the context of the chromatin response to DSBs. PHF19 was shown to be crucial for the γH2AX signaling and formation of the repair focus. PHF19-depleted cells experienced global chromatin decondensation and a significant decrease in γH2AX foci intensity post-X-ray irradiation. Moreover, PHF19 knockdown caused DSB repair delay compared to wild type cells. In accordance with the γH2AX signaling impairment, the lack of the PHF19 protein hindered RAD51, RAD52, 53BP1, pATM and RNF8 recruitment to sites of DSBs. Both general ubiquitination and H2AK119ub specifically were decreased at the sites of breaks. With the use of ubiquitin binder probes, we showed that ubiquitination is reduced at the sites of the damage in living PHF19 knockdown cells. Additionally, we showed that PHF19 association with the DSB site reaches its maximum one hour post-irradiation. In conclusion, these findings provide previously unknown ubiquitin-dependent signaling cascades in the DDR and underline the role of chromatin ubiquitination in DSB repair suggesting possible targets for anti-cancer therapy.
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Die DNA-Schadensreaktion (engl. DNA damage response, DDR) sorgt für die Aufrechterhaltung der Genomstabilität und schützt so die Zellen vor Alterung oder maligner Transformation. DNA-Schäden und die anschließende DNA-Schadensreaktion finden im Kontext des Chromatins statt. Das Chromatin steuert dabei die Schadensreaktion auf mehreren Ebenen, einschließlich posttranslationaler Veränderungen von Histon- und Nicht-Histon-Proteinen. Zu diesen Modifikationen, die an den Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) festgestellt wurden, gehören Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Ubiquitinierung. DSB-Signaling und -Reparatur finden in einer definierten Chromatin-Domäne statt, die durch die Anreicherung spezifischer posttranslationaler Modifikationen und akkumulierter Proteine gekennzeichnet ist. Diese Strukturen sind mikroskopisch sichtbar und werden als "DNA-Reparatur Foci" bezeichnet. Die Phosphorylierung von Serin 139 des Histons H2AX (als γH2AX bezeichnet) ist das Schlüsselereignis und bildet die Plattform für die anschließende Reparatur. Die Bildung und das Fortbestehen von γH2AX-Domänen spiegeln die Chromatinarchitektur und die Effizienz der DSB-Reparatur wider. Eine weitere wichtige posttranslationale Modifikation, die an der DSB-Reparatur beteiligt ist, ist die Ubiquitinierung. Ubiquitinierung ist eine kovalente Proteinmodifikation, die eine Drei-Enzym-Kaskade erfordert. Die große Anzahl an Ubiquitin-Ligasen, internen Ubiquitin-Modifikationsstellen und eine Vielzahl möglicher Ubiquitin-Signalstrukturen machen die Ubiquitinierung zu einer der komplexesten Modifikationsarten in der DNA-Schadensreaktion. Um neue Ubiquitin-Ligasen zu identifizieren, die an der DDR beteiligt sind, haben wir ein humanes Ubiquitinom-weites (663 E3-Ubiquitin-Ligasen) Hochdurchsatz-Screening durchgeführt, bei dem die Bildung und Persistenz von γH2AX-Foci als Indikator für die DSB-Reparatur nach Röntgenexposition verwendet wurde. Mehr als 100 neue Ubiquitin-Modifikatoren, die das Signaling der DNA-Reparatur (30 Minuten nach der Bestrahlung) und/oder die Reparatur selbst (24 Stunden nach der Bestrahlung) beeinflussen, wurden bei diesem Screening identifiziert. Von den identifizierten Treffern sind 62,2 % nur mit der Schadenssignalisierung assoziiert (früher Zeitpunkt, 107 Ubiquitin-Modifikatoren), während 15,1 % der Treffer ausschließlich mit dem späten Reparaturzeitpunkt (24 h, 26 Ubiquitin-Modifikatoren) in Verbindung stehen. Die restlichen 22,7 % der identifizierten Zielgene betreffen beide Reparaturphasen (39 Ubiquitin-Modifikatoren). Eine Gen-Ontologie-Analyse und eine in silico Analyse der Protein-Protein-Interaktion ergaben für jeden Zeitpunkt Cluster von physisch interagierenden Treffern. Diese Daten lieferten eine Liste neuartiger Chromatin-Modifikatoren, die an der DNA-Schadensreaktion und -Reparatur beteiligt sind, sowie deren potenzielle molekulare Funktion. 33 der identifizierten Treffer, die sowohl frühe als auch späte Reparaturzeitpunkte betrafen, wurden in einem zweiten Screening genauer untersucht. Bei diesem Screening wurden zusätzliche Zeitpunkte verwendet und darüber hinaus der immunhistochemische Nachweis von Rad51- (homologe Rekombination) und 53BP1- (nicht-homologe Endverbindung) Foci genutzt, um Informationen über die durch den Knockdown der Ubiquitin-Ligasen betroffenen DSB-Reparaturwege zu gewinnen. Darüber hinaus haben wir eine Clusteranalyse durchgeführt und vier zeitunabhängige DNA-Reparatur-Phänotypen identifiziert, die durch die Proteine CXXC1, XIAP, RNF8 und RNF168 repräsentiert werden. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die molekulare Funktion eines der Treffer, PHF19, im Zusammenhang mit der Chromatinreaktion auf DSBs untersucht. Es wurde gezeigt, dass PHF19 für das γH2AX-Signaling und die Bildung des Reparaturfokus entscheidend ist. Bei PHF19-depletierten Zellen kam es zu einer globalen Chromatindekondensation und einer signifikanten Abnahme der Intensität der γH2AX-Foci nach Röntgenbestrahlung. Darüber hinaus führte der PHF19-Knockdown zu einer Verzögerung der DSB-Reparatur im Vergleich zu Wildtyp-Zellen. In Übereinstimmung mit der Beeinträchtigung der γH2AX-Signalisierung behinderte das Fehlen des PHF19-Proteins die Rekrutierung von RAD51, 53BP1 und RNF8 an DSB-Stellen. Sowohl die allgemeine Ubiquitinierung als auch die spezifische H2AK119ub waren an den Bruchstellen verringert. Mit Hilfe von Ubiquitin-Binder-Sonden konnte ich zeigen, dass die Ubiquitinierung an den Stellen der Schädigung in lebenden PHF19-Knockdown-Zellen reduziert ist. Außerdem konnte ich zeigen, dass die Assoziation von PHF19 mit der DSB-Stelle eine Stunde nach der Bestrahlung ihr Maximum erreicht. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Ergebnisse bisher unbekannte, von Ubiquitin abhängige Signalkaskaden in der DDR aufzeigen und die Rolle der Ubiquitinierung von Chromatin bei der DSB-Reparatur unterstreichen, was mögliche neuartige Ansatzpunkte für eine Krebstherapie bietet.

Deutsch
Status: Verlagsversion
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-280859
Sachgruppe der Dewey Dezimalklassifikatin (DDC): 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Fachbereich(e)/-gebiet(e): 10 Fachbereich Biologie
10 Fachbereich Biologie > Cell Biology and Epigenetics
Hinterlegungsdatum: 20 Sep 2024 08:34
Letzte Änderung: 23 Sep 2024 09:01
PPN:
Referenten: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Löbrich, Prof. Dr. Markus
Datum der mündlichen Prüfung / Verteidigung / mdl. Prüfung: 1 Juli 2024
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