Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung und Charakterisierung von multispezifischen symmetrischen Antikörpern für die Krebsimmuntherapie. Im Gegensatz zu asymmetrischen Antikörpern, bei denen Protein Engineering Technologien angewendet werden müssen, um die korrekte Paarung der verschiedenen Polypeptidketten zu gewährleisten, bestehen symmetrische Antikörper aus zwei identischen schweren und leichten Ketten. Folglich weisen diese Moleküle hinsichtlich der etablierten Herstellung und des konventionellen Zulassungsverfahrens ähnliche Eigenschaften wie monoklonale Antikörper (mAb) auf. Two-in-One Antikörper sind symmetrische tetravalente IgG-ähnliche bispezifische Antikörper (bsAbs), bei denen jedes Antigenbindungsfragment (fragment antigen binding, Fab) zwei verschiedene Antigene adressiert. Die gleichzeitige Bindung von zwei tumorassoziierten Antigenen (TAAs) auf derselben bösartigen Zelle bietet Vorteile wie erhöhte Spezifität und geringere Immunevasion. Die Optimierung der Affinität kann die Wirksamkeit von Arzneimittelkandidaten weiter verbessern und unerwünschte Nebenwirkungen begrenzen.

Die erste Untersuchung im Rahmen dieser kumulativen Dissertation befasste sich mit der Generierung eines symmetrischen Two-in-One Antikörpers, der den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und den programmierten Zelltod-Liganden-1 (PD-L1) bindet, zwei therapeutische Zielmoleküle, die in vielen soliden Tumoren hochreguliert sind. Dazu wurde die schwere Kette eines vom Huhn stammenden anti-PD-L1 common light chain (cLC) Antikörpers mit einer vom Huhn stammenden anti-EGFR Hefe-Display (YSD) Antikörperbibliothek kombiniert und anschließend auf Bindungseigenschaften an beide Antigene untersucht. Der isolierte Two-in-One Antikörper HCP-LCE adressierte EGFR und PD-L1 gleichzeitig mit demselben Fab-Fragment und wies vorteilhafte biophysikalische Eigenschaften auf. BLI-Messungen und zellbasierte Assays ergaben, dass HCP-LCE die EGFR-Signalübertragung durch Bindung an die EGFR Dimerisierungsdomäne II hemmt und die PD-1/PD-L1-Interaktion blockiert. Bemerkenswerterweise wurden beide Antigene mit vergleichsweise geringen Bindungsaffinitäten im zweistelligen bis dreistelligen nanomolaren Bereich adressiert, jedoch wurden spezifische und hochaffine zelluläre Bindungseigenschaften auf EGFR- und PD-L1-doppelpositive Tumorzellen nachgewiesen. HCP-LCE ist der erste Two-in-One Antikörper ohne complementarity-determining region (CDR) Engineering, der mit einem einzigen Fab-Fragment zwei Antigene gleichzeitig bindet. Dieser Ansatz der Bibliotheksgenerierung ebnet den Weg für die weitere Entwicklung von aus der Vogelimmunisierung stammenden Two-in-One Antikörpern mit maßgeschneiderten Bindungseigenschaften.

In dem zweiten Projekt wurde ein symmetrischer trispezifischer natürlicher Killer (NK) Zell-Engager (NKCE) auf der Grundlage des zuvor isolierten Two-in-One Antikörpers entwickelt. Durch die gleichzeitige Adressierung eines TAA und eines spezifischen Markers auf der Oberfläche von NK-Zellen wird die Immunfunktion von NK-Zellen zur Eliminierung von Tumorzellen für die Tumortherapie nutzbar gemacht. Zum Aufbau eines solchen Antikörpers wurde die cLC-Technologie eingesetzt, eine etablierte Methode zur Vermeidung von Fehlpaarungen der leichten Kette in multispezifischen Antikörpern. Dazu wurde die leichte Kette des Two-in-One Antikörpers HCP-LCE als cLC für die Herstellung einer vom Huhn stammenden anti-CD16a YSD-Bibliothek verwendet. Das isolierte cLC Fab-Fragment, das an CD16a bindet, wurde in einer Head-to-Tail-Konfiguration mit dem parentalen Two-in-One Antikörper fusioniert, wodurch ein symmetrischer trispezifischer 2+2 Antikörper entstand, der gleichzeitig EGFR, PD-L1 und CD16a mit sechs unabhängigen Paratopen auf vier Fabs adressierte. Der Antikörper zeigte eine spezifische zelluläre Bindung an EGFR- und PD-L1-doppelpositive Tumorzellen und verursacht eine NK-Zell-vermittelte Tumorzellabtötung (ADCC) bereits bei niedrigen Konzentrationen. Diese Studie leistet Pionierarbeit bei der unkomplizierten Herstellung trispezifischer cLC Immunzell-aktivierender Antikörper in einem 2+2 Design, die aufgrund ihrer symmetrischen Architektur die nachfolgende Prozessentwicklung erleichtern.

Der dritte Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Affinitätsoptimierung des Two-in-One Antikörpers hinsichtlich der EGFR-Bindung durch zielgerichtete Mutagenese und YSD in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Einzelne Aminosäuren der CDR1 und CDR3 der leichten Kette wurden randomisiert, und die resultierende YSD Bibliothek lieferte eine Two-in-One Variante, die eine 60-fache Verbesserung der EGFR-Bindungsaffinität durch den Austausch einer einzelnen Aminosäure an Position drei der CDR3 der leichten Kette aufwies, während die PD-L1-Bindung nicht beeinträchtigt wurde. Die AlphaFold2-basierte Modellierung sagte voraus, dass der Austausch der neutralen Aminosäure Tyrosin gegen die saure Aminosäure Glutaminsäure die Bildung einer zusätzlichen Salzbrücke zwischen der eingeführten Glutaminsäure und einem Arginin an EGFR-Position 165 verursacht. Die erhöhte Affinität wurde durch BLI-Messungen, Echtzeit-Antigenbindungsmessungen auf Oberflächen mit einer Mischung aus beiden rekombinanten Proteinen und zellulären Bindungsstudien mittels Durchflusszytometrie und Echtzeit-Interaktionszytometrie nachgewiesen. Dieser Ansatz zur Affinitätsoptimierung bietet eine breit anwendbare generische Strategie für die Affinitätsreifung von Two-in-One Antikörpern.