Schuster, Carolin (2024)
Isolierung neuer Cyanid-produzierender Bakterien, Identifizierung und Manipulation der Cyanidsynthaseoperons zur Optimierung der Biolaugung von Edelmetallen.
Technische Universität Darmstadt
Dissertation, Erstveröffentlichung, Verlagsversion

Kurzbeschreibung (Abstract)

Cyanwasserstoff, auch als Blausäure bekannt, ist eine toxische chemische Verbindung. Die bisher bekanntesten bakteriellen Cyanidproduzenten sind Pseudomonas aeruginosa PAO1, Ps. fluorescens/protegens CHA0, Chromobacterium violaceum und Priestia megaterium. Bakterielle Cyanidproduktion wird für den Pflanzenschutz und für Biolaugungsverfahren verwendet, insbesondere von Edelmetallen, wie Silber und Gold, aus Erzen oder Abfallstoffen. Durch die vom hcnABC-Operon kodierte Cyanidsynthase wird Glycin von Bakterien über Imminoessigsäure zu Cyanid und CO2 oxidiert. In dieser Arbeit wurden erstmals gezielt 55 halo-/alkaliphile und Cyanid-produzierende bzw. resistente Bakterien mit einer Cyanidproduktion von bis zu 18 mg/l isoliert. Die Mehrheit dieser Bakterien gehörte dem Phylum Firmicutes an, jedoch wurden auch Proteobakterien und Bacteroidetes isoliert. Am häufigsten waren Isolate der Gattungen Salipaludibacillus und Alteribacter vertreten. Alle Isolate gehörten der Risikostufe 1 an und waren alkalitolerant. Drei Neuisolate waren alkaliphil und vier Isolate halophil. Insbesondere Isolate der Gattung Mongoliicoccus wiesen eine Resistenz gegenüber ≤ 10 mM Kupfer auf, silberresistente Bakterien wurden nicht isoliert. 18 Neuisolate wurden auf ihre Laugungsfähigkeit mit einem Filterstaub getestet. Hierbei zeigte das Isolat Ps. donghuensis G2#25 die Fähigkeit aus fünf von acht getesteten Biolaugungssubstraten, u.a. aus dem Filterstaub, Gold zu laugen. Die Goldausbeute durch Biolaugung wurde für eine Elektroschrott-Verbrennungsasche durch eine Vorbehandlung mit Lauge verdoppelt. Anschließend wurde mit Hilfe von statistischer Versuchsplanung eine Medienoptimierung durchgeführt, diese ergab eine erneute Verdopplung der Goldausbeute im Vergleich zu dem Standard-Laugungsmedium. In Ps. fluorescens erfolgt die in vivo Regulation der der hcnABC-Transkription durch den anaeroben Regulator ANR. Zum Verständnis der Regulation der Transkription von hcnABC in Ps. donghuensis, zur Erhöhung der Cyanidproduktion, zur Steigerung der Biolaugungsaktivität, aber auch zur gezielten Deletion der hcn-Operons, wurde ein CRISPR/Cas9-System für das Ps. donghuensis G2#25 Eigenisolat etabliert. Es wurden gezielte hcnABC-Promotor- und Operatorveränderungen im Chromosom durchgeführt. Der Austausch des nativen hcnABC-Promotors gegen den induzierbaren PBAD-Promotor führte zu einer erhöhten Cyanidproduktion und zu einer gesteigerten Goldausbeute in den Biolaugungsexperimenten. Die Genomsequenzen von 18 Cyanid-produzierenden Eigenisolaten aus dieser und früheren Arbeiten wurden bestimmt. Ziel war es, die Bakterien näher zu charakterisieren und hcn-Operons zu identifizieren. Aus den 18 Genomsequenzie-rungen wurden 13 geschlossene Genomsequenzen erhalten, die übrigen fielen in mehrere Contigs. In Ps. donghuensis G2#25 wurde, wie auch in Ps. protegens CHA0, neben hcnABC ein zusätzliches putatives Gencluster identifiziert, dessen Genreihenfolge in hcnCAB geändert war. In dem ebenfalls Cyanid-produzierenden Eigenisolat Ps. hutmensis MG#27 wurde ein ähnliches Gencluster identifiziert, ohne dass ein hcnABC-Homolog vorhanden war. Die Identitäten der abgeleiteten Aminosäuresequenzen lagen zwischen 24 % und 40 % zu HcnABC, in 3D-Strukturvorhersagen waren die Untereinheiten beider Proteine jedoch ähnlich. Erst später stellte sich heraus, dass das hcnCAB-Gencluster in Pseudomonaden vermutlich eine D-Hydroxyprolin-Dehydrogenase codiert. Trotzdem führten getrennt durchgeführte chromosomale Deletionen von hcnABC und hcnCAB in Ps. donghuensis zum Verlust der Biolaugungsaktivitäten. In den 18 Genomsequenzen wurden nur in zwei Salipaludibacillus Isolaten hcn-ähnliche putative Cyanidsynthaseoperons identifiziert, jedoch mit veränderter Genreihenfolge und einem Austausch von hcnA gegen ein nicht-homologes Gen. Trotz nachgewiesener Cyanidproduktion wurden bei 14 der genomsequenzierten Eigenisolate keine hcn-ähnlichen Gene identifiziert. Dies legt die Vermutung nahe, dass entweder die Sequenzen der Cyanidsynthase nicht konserviert sind oder dass es weitere bisher unbekannte Mechanismen zur Cyanidproduktion in Bakterien gibt. Zur näheren Charakterisierung der Cyanidsynthase wurde versucht, das Protein zu reinigen. In E. coli Bl21 heterolog exprimierte hcnABC-Gene erwiesen sich als ungeeignet zur Reinigung der Cyanidsynthase, da das Protein nach dem Zellaufschluss in der partikulären Fraktion verblieb. Bei einer Anreicherung der Cyanidsynthase nativ aus Ps. donghuensis verblieb sie in Lösung nach der Abtrennung der Membranbestandteile. Die Cyanidsynthase wurde hierbei über ein Plasmid exprimiert und mit einem Strep-tag C-terminal an HcnC markiert. Eine Reinigung der Cyanidsynthase durch Affinitätschromatographie war nicht erfolgreich, da der Strep-tag wahrscheinlich maskiert war. In vitro Cyanidaktivitätstests mit Zellextrakten der Cyanidsynthase, welche anaerob angereichert wurden, zeigten ein Temperaturoptimum des Enzyms bei 27 °C, Unterschiede zwischen 25 °C und 30 °C waren gering. Die Cyanidproduktion von Zellextrakten, resultierend aus einer aeroben und einer anaeroben Proteinanreicherung, lag bei 0,5 mg/l bzw. 5,4 mg/l. Dies legt die Vermutung nahe, dass die Sauerstoffsensitivität ein möglicher Grund für die nicht erfolgreiche Proteinreinigung ist.

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