Rapamycin und FK506 sind Naturstoffe, die eine hoch konservierte Macrolidstruktur und einen Pipecolat-Kern besitzen, die es Ihnen ermöglichen, mit der PPIase-Domäne von FK506-bindenden Proteinen (FKBPs) zu interagieren. In einem ersten Schritt führt das zu einer chemisch induzierten Dimerisierung des FKBP:glue Komplexes mit entweder dem mammalian target of Rapamycin (mTOR) oder der Phosphatase Calcineurin (CaN). Diese werden dadurch inhibiert was die Immunantwort supprimiert. Diese molekularen Kleber werden zufällig entdeckt. In pulldown assays wurden andere Naturstoffe wie Antascomicin B, Meridamycin und 3-Normeridamycin identifiziert, die durch ihren hoch konservierten Pipecolat-Kern an die PPIase-Domäne von FKBP12 in derselben nanomolaren Reichweite wie Rapamycin und FK506 binden. Antascomicin B zeigte im Vergleich zu Rapamycin und FK506 keine Immunsupprimierenden Eigenschaften. Bisher wurde keine ternäre Komplex Formation von Antascomicin B mit einem Protein von Interesse beschrieben, weshalb sich der Naturstoff auch als ‚orphan‘ molecular glue bezeichnen lässt. Um eine zuverlässige Methode für die Entdeckung von potenziellen ternären Zielproteinen von Antascomicin B zu entwickeln, wurde eine Affinitätschromatographie mittels immobilisiertem FKBP12 oder FKBP51 FK1 angewendet. Während die rekombinanten FKBPs mit Rapamycin und GST-FRB einen Komplex bildeten, wurde nach Anwendung in HEK293T-Lysaten keine endogene mTOR-Kinase nachgewiesen. Wenn HEK293T Zellen mit FKBPs mit zusätzlichem FLAG tag transfiziert und mit Rapamycin behandelt wurden, konnte mTOR nach einem Affinitäts Pulldown nachgewiesen werden. Dies führte dem Schluss, dass ein in-cell Ansatz für die Detektion von potenziellen Protein-Protein Interaktionen geeigneter ist. Die unnatürliche Aminosäure 4-para-benzoyl-phenylalanine (pBpa) wurde als Photo-crosslinker mittels „amber suppression“ in FKBP51- and FKBP12-Mutanten eingeführt. Der Einbau von pBpa an Positionen K52 und P120 in FKBP51 führte nach Transfektion in HEK293T Zellen und Behandlung mit Antascomicin B und UV-Licht zu einer Verstärkung eines Photo-Crosslinks mit einem molekularen Gewicht von 120/125 kDa. Weitere Untersuchungen mittels Massenspektrometrie und Western Blot unterstrichen die Hypothese, dass Antascomicin B die Interaktion von FKBP51 und Akt1 unterstützt. Zusätzlich wurde in der Massenspektrometrie die Checkpoint Kinase 1 (Chk1) als potenzieller Interaktionspartner identifiziert. Die Stabilisierung der aktiven und inaktiven Konformation an den Positionen Thr308 und Ser473 mittels Akt1-Konstrukten hatte keinen Einfluss auf die ternäre Komplexbildung von Antascomicin B und FKBP51K52pBpa oder FKBP51P120pBPa nach UV-Bestrahlung. Als das kleinere homolog FKBP12 durch ortsspezifische in-cell photo-crosslinking untersucht wurde, zeigte sich nach Behandlung mit Rapamycin und UV-Bestrahlung ein starker Photo-Crosslink bei 35 kDa. Photo-Crosslinks, die die ternäre Komplex Formation von FKBP12:Rapamycin:mTOR zeigten, wurden nicht gefunden, obwohl die FKBP12-Mutanten einen ternären Komplex imitierten. Jedoch konnte die überexprimierte FRB-Domäne von mTOR nach Behandlung mit Rapamycin und UV-Bestrahlung in co-transfizierten HEK293T Zellen durch Photo-Crosslinking quervernetzt werden. Zusammengenommen zeigen die Daten, dass ortsspezifisches Photo-Crosslinking in lebenden Zellen eine geeignete Methode ist, um molekulare Kleber zu untersuchen.